動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 臓器の分離
>注:ウイルスは室温(RT)で安定していないため、ウイルス力価を維持するために一度に収穫する動物の数を慎重に計画する必要があります。
- 必要な表現型に基づいて、選択した用量と経路を使用してマウスに感染させます。このプロトコルでは、8-10週齢の男性と女性のI型インターフェロン受容体欠損症(Ifnar1-/-)C57BL / 6マウスに感染します。
- ケタミン(90 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)のカクテルでIfnar1-/-マウスに麻酔をかけます。.つま先をしっかりとつまんでペダル反射をテストし、麻酔を確認します。フットパッドを介して、50μLのZIKVの1 x 105フォーカスフォーミングユニット(FFU)を皮下(SC)で投与します。
- 前日の収穫に必要なすべての材料を準備します 2つのはさみ、鉗子、および20mLの70%エタノール(EtOH)を50mLの円錐形に入れて、ツールの消毒を行います。
- シリンジと針を準備します:灌流用の20 mLシリンジ、23 Gの針(ケージあたり約1本)、および25 Gの針が入った1 mLシリンジ(3〜5匹のマウスごとに1本)。.チューブを計量する前に、1.5 mL Oリングスクリューキャップチューブ(臓器ごとに1つ)にスチールビーズ(フード内)を追加します。チューブは均質化に適している必要があります。
- 収穫の日、灌流と臓器凍結に必要な材料を準備します。
- アイスバケツにドライアイスと70%EtOHを入れてアイスバスを作ります。脊髄には、灌流ごとにマウス1匹あたり25〜30mLのPBSが必要であると仮定して、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を準備します。麻酔、ケタミンとキシラジンのカクテルを入手し、マウスあたり300μLと仮定します。フローサイトメトリー等に必要な全ての材料と追加チューブを二次容器に入れ、動物施設に輸送します。
- 動物施設への出入り時には、個人用保護具の着用と脱着など、入館に必要なすべての手順に従ってください
注意： すべての手順は、バイオセーフティレベル2ラボ(BSL-2)施設内の認定バイオセーフティキャビネットで実施されます。
- 動物のサイズと体重に応じて、200〜500μLの麻酔を腹腔内に投与します。一人で作業する場合は、臓器摘出前に動物を殺さないように、一度に1匹の動物に麻酔を投与します。
- 鉗子でつま先をつまんで麻酔線量を確認し、ペダル反射を評価します。完全に応答しなくなるまで続行しないでください。ピンを使用して、マウスをワックスボードに固定します。この時点で、臓器摘出手順での毛髪汚染を避けるために、マウスを70%エタノールに浸します。
- 心臓穿刺による末期出血。
- はさみと鉗子を使用して、胸腔を通して動物を開き、心臓を露出させます。心臓穿刺(~800μL)で採血し、臨床化学、血液学、抗原特異的反応を検出するためのフローサイトメトリー、ウイルスのコピー数を分析するためのリアルタイム定量PCR(qRT-PCR)など、複数のアッセイに使用することができます。
- qRT-PCRによるウイルスRNA解析では、全血から抽出する場合はEDTAチューブに、血清から抽出する場合は微量遠心チューブに血液を採取します。(血清の場合は、チューブを遠心分離機で室温で最高速度で20分間回転させ、血清を別のチューブに移します)。仕上げ後、線状ポリアクリルアミドを担体として血清サンプルに加えます。その後、RNAを分析または-80°Cで保存して、後日さらに処理することができます。
- 20 mLシリンジにPBSを室温(または37°C)で満たし、バタフライ針を左心室に挿入してマウスを灌流します。右心房に穴を開けて、血液とPBSが出るようにします。肝臓の色を確認しながらPBSをゆっくりと投与し、動物が完全に灌流されていることを確認します。肝臓は深紅からカラフトマスの色に変わるはずです。
- 組織学のために臓器を準備する場合は、蝶の針を所定の位置に残し、次に20mLの氷冷した4%パラホルムアルデヒドで灌流します。その場合は、シリンジを3方向ストップコックに接続し、両方のシリンジを取り付けて、PBSとPFAを交互に切り替えながらバルブをONおよびOFFすると便利です。
- 臓器をラベル付きの計量チューブに採取します。末梢臓器については、肝臓、脾臓、腎臓、肺など、確立された収穫順序に従ってください。
- 肝臓から片方の葉だけを取り、どれを選んでも構いませんが、すべての実験で常に同じ葉を同じサイズの部分で取るようにしてください。同様に、腎臓と肺については、同じ腎臓と肺を取ります。フローサイトメトリーも完成させる場合は、どの臓器でも半分に切開することができます。サイトメトリーに使用する半分は、収穫が完了するまで、ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地(RPMI)で室温で保存してください。
- 収穫後すぐに、各臓器をラベル付きのチューブに入れ、ドライアイス浴に入れます。ウイルスの力価は室温で時間の経過とともに低下するため、臓器を採取するのにかかる時間は非常に重要です。マウス間に一貫性がなければならないので、安全性の次に優先されるのは速度です
手記： ウイルス力価のために臓器を採取する場合、この時点で2人目の個体が脳を採取し、ウイルス力価を保存することは非常に役立ちます。
- マウスの体腔から残りの臓器を取り出して、脊椎と頭蓋骨にアクセスします。
- マウスをボードから取り外し、毛皮を取り外し、続いて腕と脚を取り外します。
斬首、鈍器、または外科用ハサミでマウスの頭を取り除き、鋸歯状のラグランジュハサミで頭蓋骨を大孔を通して切断することにより、脳を収穫します。次に、鉗子で頭蓋骨を剥がし、へらで脳をすくい取ります。
- 強くて鈍いハサミを使用して、脊椎を囲む肋骨やその他の骨を取り除きます。次に、骨盤の骨を横切って切断し、腰椎レベルで椎間孔を露出させます。この時点で、脊髄の小さな先端が見えるはずです。
- PBSで満たされた10mLの注射器と18Gの針を使用して、腰椎から頸椎までのコードをペトリ皿で「洗い流す」ことにより、脊髄を排出します。
- 針が椎体に侵入するのを防ぐために過度の圧力を避けながら、針の斜めの先端を椎骨孔の内側に慎重に配置します。強く保持して椎体と針に圧力をかけ、シリンジプランジャーを押してコードを排出します。すぐに脊髄をラベル付きのチューブに移し、ドライアイス浴に入れます。
- 収穫が完了するまで、すべての動物でこの手順を繰り返します。収穫ツールを動物の間の70%エタノールに入れます。一貫性とスピードに重点を置きます。各臓器摘出の間隔は、ウイルス力価の結果を偏らせないように、一定に保つ必要があります。
- 終了したら、バイオセーフティキャビネットとすべての材料を消毒してから、動物施設から取り出します。
- アイスバスから各チューブを取り外し、チューブの重量を量って臓器の重量を決定します。臓器の重量を決定するには、臓器を含むチューブの重量から空のチューブの重量を引きます。
注:この時点で、臓器を-80°Cで凍結して後日さらに処理するか、個々のアリコートを凍結する直前に臓器を均質化することができます。サンプルを複数回凍結融解すると、ウイルス力価が低下します。したがって、1 つのプロジェクト内のすべての実験に対して同じ手順を実行することが重要です。
>2. 臓器の均質化
- ホモジナイズする各臓器について、ラベル付きの1.5 mLスナップキャップ付きチューブを3本準備します。
- 採取直後にサンプルが均質化されていない場合は、-80°Cからチューブを取り出します。サンプルを融解して均質化する必要はありません。
- サンプルを氷の上に置いて冷たく保ち、ウイルスの力価の損失を最小限に抑えます。次に、5% FBSを含む1 mLの冷たいDMEMを各臓器含有チューブに加えます。.
- メーカーの指示に従って、すぐにビーズビーターでチューブを叩きます。ビーズホモジナイザー装置でスチールビーズですべての臓器を均質化します。各臓器が完全に均質化されていることを確認してください。
- 8°Cに冷却したマイクロフュージで、12,000 x gのマイクロフュージで5分間、臓器破片をスピンダウンします。次に、チューブをアイスバケツに戻します。バイオセーフティキャビネットで、必要なアッセイのためにサンプルをチューブに分注します。次に、チューブをアイスバケツに戻します。
- フォーカスフォーミングアッセイでは、500 μLを標識チューブに分注します。次に、チューブを氷のバケツの上のラックに置きます。50 μLをRNA用のチューブに分注し、蛍光定量RT-PCR(qRT-PCR)を使用してウイルスゲノムのコピー数を測定します。
- 市販のRNA分離キットを使用して、感染した動物の臓器から全RNAを分離します。ZIKVに特異的なプライマープローブセットを使用してフラビウイルスウイルスRNAを決定、各フラビウイルスゲノムのユニークな配列を認識します。ZIKV標的配列を含むT7ポリメラーゼを使用してin vitroで生成された、定義された陽性の一本鎖RNAを含むコピーコントロールプラスミドを使用して、ウイルスのコピー数を決定します。
- 残りのサンプル(約300 μL)を3本目のチューブに分注し、必要に応じて-80°Cで保存します
注:サンプルが以前に凍結していない場合は、-80°Cで凍結します。サンプルが以前に凍結されていた場合は、フォーカス形成アッセイおよび/またはRNA単離を続行してから停止します。
3. ジカウイルスフォーカスフォーミングアッセイ
>注:ウイルスなしのコントロールとポジティブコントロールを含めることが重要です。ポジティブコントロールは、既知の濃度のウイルスストックの希釈シリーズです。すべてのコントロールを同じプレートに配置する必要はありませんが、アッセイが 5 プレートより大きくなると、より多くのコントロールを追加してプレート間で分散させる必要があります。ピペットの先端や激しい洗浄で単層を傷つけないように注意してください。複数の臓器を同じ日に、または異なる日に力価を付与できます。ただし、アッセイ条件が異なるとウイルスの力価に影響を与える可能性があるため、個々の臓器を数日間にわたって力価を測定すべきではありません。1日に個々の臓器を稼働させることを強くお勧めします。
- アッセイの日の前に、フォーカス形成アッセイに必要な細胞と試薬を調製します。
- 500 mLのDMEMと5 mLのHEPESおよび25 mLのFBSを含む増殖培地を調製します。アッセイ開始前に、Vero-World Health Organization(WHO)細胞を37°C、5%CO2の増殖培地で増殖させてください。Vero細胞は、アッセイ開始前に高継代であったり、100%フルフルエントを超えて増殖したりしてはなりません。
- 10 gのメチルセルロースを含む1 Lガラス培地ボトルと大きな攪拌子をオートクレーブし、500 mLのH2Oを含む別の1 Lガラス培地ボトルをオートクレーブして、500 mLの2%メチルセルロース溶液を調製します。オートクレーブ水が冷えている場合は、ボトルが手触りが熱くなるまで電子レンジで再加熱しますが、沸騰しません。
- 組織培養フード内で、メチルセルロースのボトルに温かい/お湯をそっと注ぎます。ボトルを部分的にキャップし、メチルセルロースが溶液になるまでホットプレートでかき混ぜます(1〜4時間)。2%メチルセルロース溶液を滅菌済みの50mLコニカルチューブに分注します。2%メチルセルロースは、必要になるまで4°Cで保存できます。
- プレートを固定するためにPBSに5%パラホルムアルデヒド溶液を調製し、必要になるまで4°Cで保存します。0.05% Triton X-100をPBSに添加して1x Focus Forming Assay Wash Bufferを調製し、RTで保存します。1x FFA染色バッファーを調製して、1 mg/mLのサポニンをPBSに添加し、必要になるまで4°Cで保存してください。これらは1〜2週間前に準備できます。
- アッセイに必要な平底96ウェルプレートの数を計算し、各臓器が三重にプレーティングされるようにします。ポジティブコントロールとネガティブコントロールのための十分な追加ウェルを含めます。
- 成長培地で十分なVero細胞を増殖させ、設計したアッセイを完了します。Vero細胞をトリプシン処理し、増殖培地に1.5 x 105細胞/mLで再懸濁してカウントします。96ウェル平底プレートのVero細胞を3.0 x 104 Vero-WHO細胞/ウェルで増殖培地中に200 μLを添加してプレート化します。
- プレートを37°C、5%CO2で一晩インキュベートし、プレートがインキュベーター内で水平になっていることを確認し、細胞がウェル内に均等に分布していることを確認します
注:各研究室では、Vero細胞の増殖方法がわずかに異なります。ターゲットは、ジカウイルスのアッセイの日に各ウェルに90〜95%のコンフルエント単層 が存在することです。
- アッセイ当日にジカウイルスサンプルを希釈します。臓器サンプルが以前に均質化されていた場合は、-80°Cの冷凍庫からサンプルを取り出し、解凍してから、サンプルを氷上に置いてアッセイを行います。
- 氷上で、180 μLの冷間成長培地を列BからHに追加して、丸底の96ウェルプレートを準備し、列Aを空にします。均質化された各臓器サンプル150μLを丸底プレートの列Aに加えます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各サンプルの10倍希釈液を連続して調製します。丸底の96ウェルプレートでサンプルを希釈するには、20 μLのサンプルを180 μLの成長培地に加え、希釈ごとにピペットチップを交換します。
- Vero細胞を覆う平底96ウェルプレートから培地を取り出して、フォーカス形成プレートを調製します。これは、単分子膜が乾燥するのを防ぐために、ウイルスサンプルを追加する直前に行ってください。
- Veroプレートの各ウェルに100 μLのウイルス希釈液を加えます。同じチップセットを使用して、最も低い濃度から最も高い濃度へとサンプルを追加します。岩板を左右に2〜4回、渦を巻かないように注意します。
- 37°C、5%CO2で1〜2時間インキュベートし、プレートがインキュベーター内で水平であることを確認してください。インキュベーション中に2%メチルセルロースをRTにウォームアップします。
- 成長培地中の2%メチルセルロース溶液を希釈します。希釈は、成長培地に対する2%メチルセルロースの約2:1の比率である必要があります。使用する時間になるまで室温で保管してください。メチルセルロース:増殖培地を1〜2滴/ウェル(ピペットを125μLに設定)を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
- 37°C、5%CO2で32-40時間インキュベートします。Vero細胞は人によってわずかに異なる成長を遂げ、細胞の密度やジカウイルスの株などの要因によってインキュベーション時間が変わることがあります。
- 調製した5%パラホルムアルデヒド溶液を使用してVero細胞を固定します。
- バイオセーフティキャビネットのメチルセルロース層の上に50 μLの5%パラホルムアルデヒドを各ウェルに加えます。RTで60分間インキュベートします。固定は4°Cで一晩行うことができますが、蒸発を減らすためにプレートをパラフィルムで覆います。
- オーバーレイと培地を細胞からバイオセーフティキャビネット内の廃棄容器に捨てます。PBS、150μL/ウェルでやさしく洗浄してください。プレートからPBSを取り外し、BSL-2からプレートを取り外します。
- PBS洗浄を2回繰り返し、150μL/ウェルを加えます。次に、PBSを取り外します。150 μL/ウェルの1x FFA洗浄バッファーを添加し、室温で5〜10分間放置して、固定細胞を透過処理します。
- 一次ジカ抗体を用いて感染を検出します。一次抗体4G2(D1-4G2-4-15)をFFA染色バッファー中で1 μg/mLの濃度で調製します。アッセイ全体に十分な抗体を調製します.
手記： ラボ用おむつやその他の糸くずの出る吸収性材料は、繊維が病巣のイメージングに悪影響を与えるため、近づかないでください。
- プレートからFFA洗浄バッファーを取り外します。FFA染色バッファーに一次抗体50 μL/ウェルを加えます。プレートをパラフィルムで密封し、ロッキングプラットフォーム上で4°Cで一晩インキュベートします。このアッセイは、RTで2時間のインキュベーションで行うことができます。
- 二次HRP標識抗体を添加して感染を視覚化します。FFA染色バッファー中に1:5,000の濃度で二次ヤギ抗マウスHRP標識抗体を調製します。アッセイ全体に十分な抗体を調製します。
- 細胞をFFA洗浄バッファーで3回洗浄し、毎回シンクにフリックして洗浄バッファーを取り除きます。FFA染色バッファー中の二次抗体で細胞を50 μL/wellで染色します。RTで1〜2時間インキュベートします。
- 細胞をFFA洗浄バッファーで3回洗浄し、毎回シンクにフリックして洗浄バッファーを取り除きます。Trueblue基板を50 μL/ウェル加えます。
- プレートを注意深く観察し、スポットが完全に定義され、背景が最小限になるまで2〜15分待ちます。シミが見えたら、手で単層を水の流れの力から保護し、水でやさしく洗います。ペーパータオル(おむつではない)で軽くたたいて乾かし、できるだけ早くイメージを立てます。
- スポットは手動でカウントすることも、自動スポットカウンターを使用してカウントすることもできます。手動でカウントする場合は、解剖スコープを使用して視覚化に役立てることができます。
- 各サンプルについて、識別しやすい病巣(例:ウェルあたり20〜200)の希釈を選択し、重複するウェルの平均を使用して、フォーカス形成単位/mL(FFU/ml)で力価を計算します:FFU/mL =(平均病巣/ウェル)×(希釈係数)÷(mL接種物)。
