機械感覚受容体に対する抗体で処理した血小板に対するせん断応力の影響

要約

出典: Quach, M. E. et al., A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、せん断応力が血小板に与える影響を評価する方法を示します。抗体治療は、機械受容器複合体の解離と構造変化を誘導し、血小板を活性化し、表面にマーカーを発現させます。これらのマーカーは、免疫染色およびフローサイトメトリーによって観察されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 採血と血小板分離

1. 実験当日に静脈穿刺を介して同意した健康な成人ドナーからヒトの血液を採取し、3.8% クエン酸三ナトリウムに注入します。血小板数がμLあたり250 x 10³に近いドナーの20〜25の状態に対して十分な多血小板血漿(PRP)を生成するには、1本の4.5mLチューブで十分です
   手記：細いゲージの針(21 G未満)で採血することは避けてください。
2. PRPを22°Cおよび140 x gで12分間遠心分離し、長いブレーキで調製します。これにより、下部に赤血球、上部に明るい色のPRPという2つの異なる層が作成されます。
3. 45°の角度でカットしたピペットチップを慎重にピペッティングして、PRPの上部の曇った黄色の層を分離し、全血球計算(CBC)を介して血小板数を取得します。
4. 必要に応じて、プロスタグランジンE1(PGE1)の存在下で1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸ナトリウム塩(PIPES)緩衝生理食塩水(150 mM塩化ナトリウム、NaCl、20 mM PIPES)で血小板を洗浄し、チロード緩衝液(134 mM NaCl、0.34 mMリン酸二ナトリウム、Na₂HPO₄、2.9 mM塩化カリウム、KCl、1 mM塩化マグネシウム)で血小板を洗浄します。 MgCl₂、5 mMグルコース、12 mM重炭酸ナトリウム、NaHCO₃、20 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、HEPES、pH 7.35)と5 mMグルコース、それ以外の場合は、ステップ1.5に進みます。次の手順では、洗濯について簡単に説明します。
   1. PIPES緩衝生理食塩水でPRP容量を10 mLに調整し、0.6 μM PGE1を加えます。
   2. 1,900 x gで8分間遠心分離し、上清を捨てて、血小板ペレットを400 μLのチロードとグルコース溶液に5分間
   放置します。
   3. 血小板ペレットを静かに再懸濁し、30分間邪魔されずに保ちます。
5. プールされたヒト血小板低血漿 (PPP) を使用して、血小板数を ~250 x 10 3 血小板/μL に調整し、懸濁液を邪魔されずに、または穏やかに回転させて 22 °C に保ちます。

2. 抗体と均一せん断処理

>注:ピペッティングが必要なセクション2のすべてのステップは、せん断が発生しないようにゆっくりと実行する必要があります。

1. PRPまたは洗浄した血小板に目的の抗体を添加し、ピペッティングで上下させるか、ピペットチップで攪拌して穏やかに混合します。室温で5〜10分間放置します。同量の PPP または Tyrode のバッファーをネガティブ コントロールに追加します。
2. コーンプレート粘度計をオンにし、プレートの温度を22°Cに設定し、プレートがこの温度に達するまで待ちます。
3. 処理したPRPまたは洗浄した血小板を、プレートの中央にある温度制御されたコーンプレート粘度計に直接ピペットで移します。すべてのサンプルがコーンとプレートの間の接触点に堆積し、コーンの縁の外側に堆積していることを確認します。
4. 適切な速度と持続時間でせん断します。
   1. 粘度計のマニュアルに示されているように、または前に示されているように、せん断を計算します。
   2. 粘度とニュートンの粘度の法則による所望のせん断応力からせん断速度を決定します。; プラズマの粘度は1.5-1.6センチポアズ(cP)です。たとえば、人間の循環の通常のせん断範囲は5〜30 dyn / cm²であり、せん断は1桁の分時間スケールで適用する必要があります。
5. コーンをプレートからわずかに(~2 mm)持ち上げて、サンプルがプレートとコーンの両方に接触したままになるようにし、ゲルローディングまたはその他の長いピペットチップを使用して、サンプルボリュームの中心から5〜10μLを収集します。
6. 剪断したサンプルを目的のマーカーと室温で20分間インキュベートします。ホスファチジルセリン、β-ガラクトース、およびP-セレクチン曝露のマーカーには、0.08 μMのラクタドヘリンC2ドメイン(LactC2)、6.25 μg/mLのErythrina cristagalli lectin(ECL)、および抗P-セレクチン抗体(20 μg/mL)をそれぞれ使用します。
7. 希釈または低温保存の前に、サンプルを2%パラホルムアルデヒドに室温で20分間固定し、ステップ3.1に進むか、サンプルを4°Cで12時間以内で保存します。

>3. フローサイトメトリーによる表面マーカーの検出と架橋

1. フローサイトメトリーでサンプルを解析し、各条件で少なくとも20,000のイベントを収集します。
2. 各蛍光色素の強度の高さ値、または幾何平均蛍光強度(MFI)を使用して、蛍光マーカーのシグナル強度を定量します。
3. せん断処理後の血小板架橋の検出を目指す場合は、イメージング対応のフローサイトメーターでサンプルを分析し、面積とアスペクト比のパラメーターで架橋を定量します。
   1. 面積やアスペクト比のヒストグラムをプロットします。
   2. ウシ血清アルブミン (BSA) またはビヒクルを使用したネガティブ コントロールを使用して、ほとんどの完全に円形のイベント (このゲートは通常、アスペクト比 ~0.8 で描画されます) を除外したゲートを描画し、このゲート内のイベントの割合を定量化します。アスペクト比が低いイベントは、クロスリンクされる可能性が高くなります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
APC抗ヒトCD62P(P-セレクチン)	バイオレジェンド	304910
ブルックフィールドキャップ2000+粘度計	ブルック フィールド	-
FITC標識Erythrina cristagalli lectin (ECL)	ベクターラボ	FL-1141
プールされた正常なヒト血漿	プレシジョンバイオロジック	CCN-10
Vacutainer ライトブルー採血チューブ(クエン酸ナトリウム)	BDの	369714
Vacutainer採血セット、21G x 3/4 "針	BDの	367287