マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

要約

出典:Sarkar, A., et al. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。

プロトコル

1. 感染のためのカバースリップへのBMMのメッキ

1. 各空のウェルの底に4枚の滅菌済み12 mmガラスカバースリップ(オートクレーブ滅菌済みで密閉ガラス容器に保存)を4枚入れて、6ウェル組織培養プレートを調製します><。 手記：滅菌済みの12mmカバースリップを、吸引チップを真空ラインに取り付けて持ち上げます。カバースリップを重ならないようにウェルに配置し、チューブをつまんで真空を中断することにより、希望の位置でカバースリップ
を解放します。
2. 接着性骨髄由来マクロファージでコーティングしたペトリ皿から培地(および非接着性細胞)を吸引し、付着細胞をカルシウムおよび塩化マグネシウムを含まない滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS-/-)で2回穏やかにすすぎます。
3. 最終濃度1 mM EDTAの滅菌済み1x PBS/-を5 mLの滅菌済み1x PBS/-を各シャーレに滴下し、37°Cで5分間インキュベートして接着性BMMを剥離します。顕微鏡を使用して細胞が剥離することを確認します。
4. 1x PBS/-に懸濁したすべての分離細胞を、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加した50 mLコニカルチューブに回収します。各ディッシュを5mLのPBS-/-で2回すすぎ、細胞懸濁液プールに加えます
   手記：細胞懸濁液は、収集プロセス中にマクロファ....

結果

図1:L. amazonensisの毒性のある無力な無菌性アマスティゴテス(A)と非毒性の対数期前マスティゴテス(B)によるBMM感染の代表的な図。BALB/cマウスから単離されたマクロファージの免疫蛍光画像、感染後1時間および48時間後。感染したマクロファージは、プロトコルに記載されているように免疫蛍光法で処理しました。PVメンブレンは、ラット抗マウスLamp1モノクローナル抗体(1:1,000希釈)で1時間染色した後、抗ウサギ蛍光IgGで1時間インキュベート(1:500希釈)しました。寄生虫染色は、無菌性L. amazonensis amastigotesに対して生成されたマウスポリクローナル抗体とカバースリップをインキュベートし、続いて抗マウスIgG赤色色素(1:500希釈)を行うことによって行いました。すべてのカバースリップは、核を染.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェル細胞培養プレート	セルスター	657160
アデニン	アクロスオーガニックス	AC147440250
エアゾールバリアピペットチップ (100-1000 μL)	フィッシャーブランド	02-707-404
エアロゾルバリアピペットチップ(20-200μL)	フィッシャーブランド	02-707-430
エアロゾルバリアピペットチップ(2-20μL)	フィッシャーブランド	02-707-432
バードパーカーリブバックカーボンスチールサージカルブレード#10	アスペン外科	371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL シリンジ	ベクトン・ディキンソン (BD)	309604
BDプレシジョングライドニードル、25G	ベクトン・ディキンソン (BD)	305124
細胞培養ディッシュ 35 mm x 10 mm	セルスター	627 160
細胞培養フラスコ	セルスター	660175
カバーグラス:12mm円	フィッシャーブランド	12-545-80
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	インビトゲン	D1306
D-ビオチン	J.T.ベイカー	C272-00
EDTAの	シグマ・アルドリッチ	EDSの
エチルアルコール200プルーフ	Pharmco-AAPERの	111000200
ファルコン 100 mm x 15 mm ノン TC 処理ポリスチレン ペトリ皿	コーニング	351029
ウシ胎児血清	セラディム	1500〜500
フィコール400	シグマ・アルドリッチ	F8016
蛍光顕微鏡	ニコン	E200
ヤギ抗マウスIgGテキサスレッド	インビトゲン	T-862
ヤギ抗ウサギIgG AlexaFluor488	インビトゲン	A-11034
ヘミン	東京化学工業株式会社	H0008
HEPESの(1M)	ギブコ	15630から080
アイソトンII希釈剤	ベックマン・コールター	8546719
L-グルタミン	双子座	400から106
ミディアム 199 (10X)	ギブコ	11825-015
Naピルビン酸(100 mM)	ギブコ	11360-070
パラホルムアルデヒド	アルファ・アエサル	43368
ペニシリン/ストレプトマイシン	双子座	400から109
リン酸緩衝生理食塩水(-/-)	サーモフィッシャー	14200166
ポリプロピリン円錐形遠心分離チューブ15 mL	セルスター	188 271
ポリプロピリン円錐形遠心分離チューブ50 mL	セルスター	227 261
ProLong Gold退色防止試薬	サーモフィッシャー	P36930
ラット抗マウスLamp-1抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク	1D4Bの
組換えヒトM-CSF	ペプロテック	300〜25
Reichertブライトライン血球計算盤	ハウサーサイエンティフィック	1492
RPMIミディアム1640(1X)	ギブコ	11875-093
トリトンX-100界面活性剤	ミリポアシグマ	TX1568-1
トリパンブルー	シグマ・アルドリッチ	T8154
繊細なはさみ、4 1/2 "	VWRの	82027-582
解剖鉗子、細い先端	VWRの	82027-386
顕微鏡スライド	VWRの	16004-368
Z1コールターパーティクルカウンター、デュアルスレッショルド	ベックマン・コールター	6605699

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