マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

要約

出典:Sarkar, A., et al. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。

プロトコル

1. 感染のためのカバースリップへのBMMのメッキ

1. 各空のウェルの底に4枚の滅菌済み12 mmガラスカバースリップ(オートクレーブ滅菌済みで密閉ガラス容器に保存)を4枚入れて、6ウェル組織培養プレートを調製します><。 手記：滅菌済みの12mmカバースリップを、吸引チップを真空ラインに取り付けて持ち上げます。カバースリップを重ならないようにウェルに配置し、チューブをつまんで真空を中断することにより、希望の位置でカバースリップ
を解放します。
2. 接着性骨髄由来マクロファージでコーティングしたペトリ皿から培地(および非接着性細胞)を吸引し、付着細胞をカルシウムおよび塩化マグネシウムを含まない滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS-/-)で2回穏やかにすすぎます。
3. 最終濃度1 mM EDTAの滅菌済み1x PBS/-を5 mLの滅菌済み1x PBS/-を各シャーレに滴下し、37°Cで5分間インキュベートして接着性BMMを剥離します。顕微鏡を使用して細胞が剥離することを確認します。
4. 1x PBS/-に懸濁したすべての分離細胞を、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加した50 mLコニカルチューブに回収します。各ディッシュを5mLのPBS-/-で2回すすぎ、細胞懸濁液プールに加えます
   手記：細胞懸濁液は、収集プロセス中にマクロファージをEDTA毒性から保護するために、追加のPBS-/-で希釈することができます。
5. 300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨て、ピペッティングでマクロファージを5〜10 mLのBMM培地に再懸濁します。再懸濁した細胞を氷の上に置いて、チューブへの付着や凝集を防ぎます。
6. 血球計算盤でトリパンブルー排除を使用して生存細胞をカウントします.
   手記： 5 mL培地に再懸濁したBMM細胞をカウントするには、445 μL PBS/-と30 μL 0.4% Trypan blue溶液に25 μLの細胞懸濁液を希釈ミックスすると、通常、血球計算盤で容易に定量できます(最終計算では20倍の希釈係数を考慮に入れます)。トリパンブルーで染色されなかった細胞(生細胞)のみをカウントします。この混合物が過度に濃縮または希釈されている場合、細胞懸濁液の量が変化する可能性があります。一般に、調製物当たりのBMMの収量は、1匹のマウスから2 x 10⁷から5 x 10⁷細胞の間で変動します。
7. BMM培地中の細胞懸濁液を所望のプレーティング濃度(5 x 10⁵/mL)で調製し、懸濁液をウェルあたり2 mL培地中の6ウェルプレートに分散させて、各ウェルが1 x 10⁶マクロファージを受け取るようにします
   手記： これは、すべてのウェルがカバーガラスを均一に覆うのに十分な数のマクロファージを確実に得るための重要なステップです。ウェルのカバースリップが媒体に重なったり浮いたりしていないことを確認してください。その場合は、滅菌ピペットチップで優しく調整します。
8. 37°C、5%CO₂で一晩インキュベートします。

2. L. amazonensisの感染型精製

>注:Leishmaniaの感染症に備える-静止した前胸茎の培養物からメタ環状前胸炎を精製するか、標準的なL. amazonensis無菌分化プロトコルを使用して、培養中の前胸茎をアマスチゴートの形態に分化します。

1. 密度勾配培地を用いたリーシュマニアメタ環状前乳房の精製 (材料)
   1. 密度勾配培地の40%ストック溶液を、エンドトキシンを含まない滅菌水で調製します。
   2. 密度勾配溶液を 10x M199 培地(血清なし)で希釈し、M199 培地に 10% の濃度を調製します。
   3. 0.22 μm filter.
      ですべての溶液をろ過 手記：ストック溶液は、4°Cの暗所で1か月以内に保存できます。
   4. 15 mL のコニカル遠心チューブの底に 2 mL の 40% 密度グラジエント培地溶液を加えます。
   5. 40%密度グラジエント培地層の上にM199の10%密度グラジエント培地溶液2 mLを2 mL重ね、パスツールピペットを使用して2つの層が混ざらないように慎重に行います。
   6. 固定相培養液から1 x 10⁹寄生虫を1,900 x gで10分間遠心分離して収集します。
   7. 細胞を6 mLのダルベッコ改変エッセンシャル培地(DMEM)に再懸濁します。
   8. 細胞懸濁液の2 mLを10%密度グラジエント培地層の真上に、パスツールピペットを使用して穏やかに層間の混合を避けます。
   9. グラジエントを室温で1,300 x gで10分間遠心分離します
      手記：リーシュマニア種間の物理的特性の違いにより、最大の収量を確保するためには、それぞれの遠心分離条件をわずかに調整する必要があるかもしれません。
   10. 上部10%密度勾配培地境界(0%と10%の密度勾配培地層の間の界面)に形成されたバンドから寄生虫(メタサイクリック前乳房型に富
   む)を収集します。
   11. 寄生虫を1容量のDMEMで希釈し、遠心分離(室温で1,900 x gで10分間)で回収します。
   12. 500 μL DMEM培地に再懸濁し、血球計算盤でカウントして収量を定量化します。
2. 無菌培養条件(低pH/高温)下でのL. amazonensis amastigotesの作製。
   1. 5 mLの対数期前乳房培養物(pH 7.4、26^°C)と等量のアマスチゴート培地(pH 4.5)を、25 cm²フラスコ(合計10 mL培地)を用いて混合し、26°Cで一晩インキュベートします。
   2. フラスコを26°Cから32°Cにシフトします。
   3. 3〜4日後、アマスチゴート培地で32°Cで1:5に培養を分割します。
   4. 次の3〜4日(最大7日間)で寄生虫をチェックして、感染症で使用する準備ができているかどうかを確認します
      手記： 健康な無菌性無菌は、目に見えるべん毛のない楕円形をしている必要があります。部分的に分化したアマスチゴテスは、短いべん毛を持つ大きな楕円形をしています。文化は多くの塊を持つべきではありません - 多くの塊は成長していない、死にかけている寄生虫の兆候です。アマスティゴートの培養物は1:5に分割し、最大3週間維持することができます。

3. L. amazonensisへの感染

1. 所望のMOI(通常、マクロファージあたり3〜5個のメタ環状前mastigotes[MOI of 1:3または1:5]、マクロファージあたり1個のamastigote[MOI 1:1])に従って寄生虫懸濁液を希釈します。すでに2 mLの培地が含まれている各ウェルに、PBS中のLeishmaniaを50〜100 μLの容量で加えます。
2. BMMをアマスチゴテスと1時間、メタサイクリック前mastigotesと3時間、34^°Cでインキュベートします。
   手記：最適な感染温度は種によって異なる場合があります。
3. インキュベーション後、各ウェル内の遊離寄生虫を3回、37°Cに予熱した2mLのPBS-/-で完全に洗い流します
   手記：PBSを穏やかに分散させて、カバーガラスが互いに浮かばないようにします。プレートを静かに回転させてから、液体を吸引します。複数の寄生虫株を使用する場合は、相互汚染を避けるために、別々の吸引チップを使用してください。
4. 各ウェルを1.5 - 2% PFAのPBS中2% PFAと10分間インキュベートし、1時間または3時間の時点のサンプルを固定します。PBSのカバースリップを含むプレートを最後に洗浄して冷蔵し、染色するまで
冷蔵しないでください。
5. 2 mLの新鮮なBMM培地をプレート上の各ウェルにさらにタイムポイントを加え、34°Cでインキュベートします。
6. ステップ4.3で説明したように、残りの時点を必要に応じて固定し、染色するまでプレートを冷蔵します。

4. DAPI染色とカバースリップ実装

1. カバーガラスを含むウェルからPBSを吸引し、1.5 mLのPBS-/-を0.1%非イオン性界面活性剤とともに加えます。室温で10分間インキュベートした後、2 mLのPBS-/-で3回洗浄します。
2. 1 mL PBS-/-を2 μg/mL 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(5 mg/mLの水溶液で希釈)とともにカバースリップを含むウェルに加え、室温でさらに1時間インキュベートします
   手記： DAPIによるインキュベーション時間は、細胞内リーシュマニア原虫を適切に可視化するために重要です。マクロファージの核は、サイズが大きく、DNA含有量が大きいため、急速に染色されますが、細胞内寄生虫の核の染色は遅くなります。したがって、DAPIが寄生虫原形質膜、および寄生虫核膜を透過できるようにするためには、BMM核を可視化するために必要な時間を超えてインキュベーション時間を延長する必要があります。適切なDAPI染色により、核DNAに加えて、寄生虫のべん毛ポケット近くのミトコンドリアキネトプラストDNAも可視化できます。
3. カバースリップを含む各ウェルを2mLのPBSで3回洗浄し、次に鉗子でカバースリップを持ち上げて反転させ、細胞側を下にして、市販の退色防止マウント試薬を使用してガラス顕微鏡スライドにマウントします><。 手記： カバーガラスは非常に壊れやすいため、取り扱いには注意が必要です。持ち上げるときは、特にウェルの側壁に対して圧力をかけないでください。PBSを数滴加えると、カバースリップとウェルの間の表面張力が低下し、吊り上げプロセスが容易になります。ファインゲージの針を使用して、ウェルの底からカバースリップをこじ開けるのを助けることができます。スライドにカバースリップを載せた後、鉗子で優しく押し下げ、封入剤中の気泡を押し出します。持ち上げプロセス中にカバースリップが壊れたり、裏返ったりした場合は、再度取り付けないでください。予備の4枚目のカバースリップを使用するだけです。
4. スライドを定量化まで冷蔵します。

5. 感染の定量化

1. 100倍対物レンズと液浸油(358 nmで励起、461 nmで最適発光)を含ませたマクロファージに焦点をあて、蛍光顕微鏡下でDAPI染色スライドを検査します。
   スライドガラスとカバーガラスの間のマクロファージの層に焦点が当てられていることを確認してください。
2. マクロファージ(DAPIで染色された大きな核)の数と、各視野の各マクロファージ核の周りに集まっている小さなアマスチゴート核の数(図1A、DAPIを参照)を、手動カウンターを使用して定量化します。
   手記： Amastigoteの核は、サイズが小さいため、すべてが1つの焦点面に見えるとは限りません。マクロファージ核に焦点を合わせたときに見えるものを数え、ファインフォーカスを使用してマクロファージ核の上下の平面に寄生虫核がないか確認します。
3. 別の視野に移動して、定量化を繰り返します。別のカウンター キーを使用して、カウントされたフィールドの数を追跡します。カウントの重なりを防ぐために、各カバースリップを横切って平行な列で視覚フィールド内を移動します。
4. カバーガラスあたり最低200のマクロファージを定量します。感染の各時点を3倍(3枚のカバースリップ)で定量化します。前のカバースリップのいずれかがカバースリップの重なり、取り付け不良、ガラスの破損などの理由でカウントに適さない場合は、4番目のカバースリップをカウントします<br /> 手記：1枚のカバースリップで200個のマクロファージを数えられない場合は、予備の4枚目を数えます。
5. amastigotes/macrophageまたはamastigotes/100マクロファージとして感染率を計算し、生の定量データから感染したマクロファージの割合を決定します。

結果

図1:L. amazonensisの毒性のある無力な無菌性アマスティゴテス(A)と非毒性の対数期前マスティゴテス(B)によるBMM感染の代表的な図。BALB/cマウスから単離されたマクロファージの免疫蛍光画像、感染後1時間および48時間後。感染したマクロファージは、プロトコルに記載されているように免疫蛍光法で処理しました。PVメンブレンは、ラット抗マウスLamp1モノクローナル抗体(1:1,000希釈)で1時間染色した後、抗ウサギ蛍光IgGで1時間インキュベート(1:500希釈)しました。寄生虫染色は、無菌性L. amazonensis amastigotesに対して生成されたマウスポリクローナル抗体とカバースリップをインキュベートし、続いて抗マウスIgG赤色色素(1:500希釈)を行うことによって行いました。すべてのカバースリップは、核を染...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェル細胞培養プレート	セルスター	657160
アデニン	アクロスオーガニックス	AC147440250
エアゾールバリアピペットチップ (100-1000 μL)	フィッシャーブランド	02-707-404
エアロゾルバリアピペットチップ(20-200μL)	フィッシャーブランド	02-707-430
エアロゾルバリアピペットチップ(2-20μL)	フィッシャーブランド	02-707-432
バードパーカーリブバックカーボンスチールサージカルブレード#10	アスペン外科	371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL シリンジ	ベクトン・ディキンソン (BD)	309604
BDプレシジョングライドニードル、25G	ベクトン・ディキンソン (BD)	305124
細胞培養ディッシュ 35 mm x 10 mm	セルスター	627 160
細胞培養フラスコ	セルスター	660175
カバーグラス:12mm円	フィッシャーブランド	12-545-80
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	インビトゲン	D1306
D-ビオチン	J.T.ベイカー	C272-00
EDTAの	シグマ・アルドリッチ	EDSの
エチルアルコール200プルーフ	Pharmco-AAPERの	111000200
ファルコン 100 mm x 15 mm ノン TC 処理ポリスチレン ペトリ皿	コーニング	351029
ウシ胎児血清	セラディム	1500〜500
フィコール400	シグマ・アルドリッチ	F8016
蛍光顕微鏡	ニコン	E200
ヤギ抗マウスIgGテキサスレッド	インビトゲン	T-862
ヤギ抗ウサギIgG AlexaFluor488	インビトゲン	A-11034
ヘミン	東京化学工業株式会社	H0008
HEPESの(1M)	ギブコ	15630から080
アイソトンII希釈剤	ベックマン・コールター	8546719
L-グルタミン	双子座	400から106
ミディアム 199 (10X)	ギブコ	11825-015
Naピルビン酸(100 mM)	ギブコ	11360-070
パラホルムアルデヒド	アルファ・アエサル	43368
ペニシリン/ストレプトマイシン	双子座	400から109
リン酸緩衝生理食塩水(-/-)	サーモフィッシャー	14200166
ポリプロピリン円錐形遠心分離チューブ15 mL	セルスター	188 271
ポリプロピリン円錐形遠心分離チューブ50 mL	セルスター	227 261
ProLong Gold退色防止試薬	サーモフィッシャー	P36930
ラット抗マウスLamp-1抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク	1D4Bの
組換えヒトM-CSF	ペプロテック	300〜25
Reichertブライトライン血球計算盤	ハウサーサイエンティフィック	1492
RPMIミディアム1640(1X)	ギブコ	11875-093
トリトンX-100界面活性剤	ミリポアシグマ	TX1568-1
トリパンブルー	シグマ・アルドリッチ	T8154
繊細なはさみ、4 1/2 "	VWRの	82027-582
解剖鉗子、細い先端	VWRの	82027-386
顕微鏡スライド	VWRの	16004-368
Z1コールターパーティクルカウンター、デュアルスレッショルド	ベックマン・コールター	6605699

(代表) (代表) (代表) の ) 年