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1. バクテリアの調製
>注:全細胞細菌基質と精製ペプチドグリカンは、マイクロスライド拡散アッセイと色素放出アッセイの両方で酵素基質として使用されます。これらの基質は、酵素反応を行う前に調製する必要があります。次のプロトコルは、それらの準備を説明しています。
- 全細菌細胞基質
- 500 mlの栄養ブロスに2 mlの枯草菌168の一晩培養液を接種することにより、細菌細胞基質を作製します(American Type Culture Collection;ATCC 23857)。30°Cで振とう(125rpm)しながら、培養物が指数関数的な増殖段階(細菌培養物が倍増する急速な成長段階と定義される段階)に達するまでインキュベートします。Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708) の培養には、37°C で振とう (125 rpm) しながら増殖培地として栄養ブロスを使用します。
- 各培養物を121°C、3気圧の圧力で10分間オートクレーブ
して加熱死滅させます。
- 加熱死滅した細菌基質を5,000 x gで20分間遠心分離して回収します。ペレットをタイプ1の水で3回洗浄し、最小限の水で再懸濁します。この研究では、基質を1,200 μlに懸濁します。
- 300 μlの細菌細胞基質を1.5 mLのマイクロチューブに分注し、20°Cで保存します。
>2.基板のラベリング-Remazol Brilliant Blue R染料のラベリング
>注:色素放出アッセイでは、基質はRemazol brilliant blue R色素と共有結合しています。次のプロトコルは、染色された酵素基質の調製について説明しています。
- 200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 溶液の作製に使用する 99 ml のタイプ I 水に 1 g の NaOH を溶解して、250 mM の水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液を作製します。
- 1.25 g RBBを98.75 mL±1 mLの新鮮な250 mM NaOH溶液に溶解して、200 mM RBB溶液を調製します。
- 加熱死滅した細菌細胞を湿重量0.5gの濃度で30mlのRBB溶液に再懸濁します。精製したペプチドグリカンの場合は、ペプチドグリカンを30 mLのRBB溶液中に0.3 g湿重量の濃度で再懸濁します。.
- 反応混合物を三角フラスコに入れ、回転プラットフォーム上で37°Cで6時間、穏やかに混合しながらインキュベートします。
- 反応混合物を4°Cのインキュベーターに移し、穏やかに混合しながらさらに12時間インキュベートします。
- インキュベーション後、染色した基質を3,000 x gで30分間遠心分離して回収し、基質ペレットから色素溶液をデカントします。
- 色素標識細胞またはペプチドグリカンをI型水で繰り返し洗浄(約3〜5回の洗浄)した後、遠心分離することにより、非共有結合性可溶性色素を基質から除去します。水を加えるたびに、ペレットを完全に再懸濁します.
手記：結合を解除すると、遠心分離後の水洗で可溶性色素が見えなくなります。基材はさらに1回洗浄する必要があります。基材は青色のままですが、最後の洗浄の上清は透明であることに注意してください。
- 染色した基材は、後で使用するために-20°Cの最小限の水に懸濁して保管してください。
3. 定量的色素放出アッセイ
>注:色素放出アッセイ中、酵素反応中のRBB染色基質の加水分解により、染色生成物が反応上清に放出されます。放出された色素の量の比色測定は、特定の酵素のサンプル内に存在する酵素活性の量を示します。定量法では、基質間で異なる酵素を比較でき、酵素反応に影響を与える環境条件(温度、塩分、pHなど)の変動が可能になります。以下のプロトコルは、タンパク質抗菌剤の酵素活性を定量的に検出するための色素放出アッセイの調製と性能を説明しています。
- 色素放出アッセイの調製
- 凍結染色した基質を室温に戻して、所定の酵素について経験的に決定されたアッセイバッファー(リン酸緩衝生理食塩水、PBS)で2回洗浄します。
- 必要な基質懸濁液の量を計算するには、200 μLの反応量に実施する色素放出アッセイの数を掛けます。
- 分光光度計を使用して、4.1.2で測定されたアッセイバッファーの容量に染色した基質を添加し、595 nmで2.0の光学密度(OD)を達成するまで、基質懸濁液を調製します。分光光度計の機能制限内にとどまるには、濃縮溶液の1:1希釈に対して2.0 OD595を1.0として測定します。アッセイバッファーをブランクとして使用します.
手記：反応の基質濁度は、高効率酵素の活性レベルに合わせて2.0を超えて上げることができます。
- 評価するタンパク質抗菌剤を推定濃度1 mg / mlのアッセイバッファーに懸濁します。
- 製造元のプロトコルに従って、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキットのマイクロプレートアッセイを使用して、アッセイするタンパク質サンプルの実際の濃度を決定します。アッセイバッファーを使用して、ストック懸濁液の濃度を1 mg/mLに調整します。
- 色素放出アッセイを使用した、タンパク質抗菌剤の最適なインキュベーション条件の決定
- ストックタンパク質抗菌懸濁液を100 ng/μlに希釈します。この濃度により、アッセイ反応に添加した容量(10 μl)あたり1 μgのタンパク質の最終反応質量が得られます。
- 細菌分解タンパク質について評価する熱範囲を決定します。これらのアッセイの熱範囲には、5 °C、15 °C、25 °C、35 °C、45 °C、55 °C、および 65 °C が含まれていました。
- 0.5 mLのマイクロチューブで反応アッセイを実施します。各温熱条件について、調製した基質懸濁液200 μlにストックタンパク質10 μlを加えます。
- サーマルサイクラーで8時間インキュベートし、1時間に1回反転して混合します。
- インキュベーション後、25 μlのエタノールを加えて反応を停止します。
- 未消化の不溶性基質を3,000 x gで2分間遠心分離して除去し、各反応混合物の反応上清150 μlを、未消化基質のペレットを乱さないように注意しながら、96ウェル平底マイクロプレートに移します。
- 酵素加水分解後に基質から解離した可溶性RBB色素の量を測定することにより、所定の基質に対するタンパク質抗菌剤の酵素活性を測定します。酵素活性を定量化するには、マイクロプレート分光光度計を使用して595 nmで上清の吸光度を測定します。標識基質から上清に放出される可溶性色素による吸光度の増加は、酵素活性の定量的測定です。
手記：吸光度の変化は活性単位(AU)で表され、1 AUは595 nmで色素放出反応上清の光学密度を0.01増加させます。酵素を除くすべての反応成分とインキュベートしたブランク反応は、インキュベーションによってRBB標識基質から放出される色素を差し引くために使用されます。最適な酵素温度は、ピーク活性単位測定を提供します。