細菌株の酸化ストレス応答を評価するためのスポットプレートアッセイ

要約

出典:Ketelboeter, L. M. et al., Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、細菌株の酸化ストレス応答を評価するために調整されたスポットプレートアッセイを示しています。一部の菌株は、抗酸化色素であるピオメラニンを生成します。逆に、試験剤で処理した株は、ピオメラニン産生の減少につながりますが、酸化ストレスに対する感受性が高く、ピオメラニン産生株と比較して細胞生存率が低下します。

プロトコル

1. 培地、抗生物質、および2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)の調製

1. Luria-Bertani(LB)ブロス(1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、0.25%塩化ナトリウム、H₂O中のNaCl)を作り、適切な量に分注します。オートクレーブで滅菌します。室温で保存してください。
2. 250mlフラスコに100mlのLB寒天(1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、0.25%NaCl、1.5%寒天_H2O)を作ります。オートクレーブで滅菌し、室温で保存してください。プレートに注ぐ前に寒天が溶けていることを確認してください.
   手記：100mlのLB寒天が入ったフラスコは、4枚のプレートを生成します。LB寒天の量は、アッセイに必要なプレート数に対応するように変更できます。
3. リン酸緩衝生理食塩水、PBS(137 mM NaCl、2.7 mM塩化カリウム、KCl、10 mMリン酸水素二ナトリウム、Na₂HPO₄、2 mMリン酸二水素カリウム、KH₂PO₄)を作成します。オートクレーブまたはろ過により滅菌し、室温で保存してください。
4. ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンの抗生物質ストック溶液を調製します。
   1. 100 mg / mlのゲンタマイシン、30 mg / mlのカナマイシン、および10 mg / mlのトブラマイシンを含む緑膿菌株の適切な抗生物質ストック濃度を準備します。.抗生物質を水に溶かし、ろ過滅菌(0.2μm)し、4°Cで保存します。

2. 酸化ストレス応答のためのスポットプレートアッセイ

1. 試験する菌株の一晩の培養を設定します。2 mLのLBブロスを16 x 150 mm試験管(株ごとに1本)に加え、各株から1つの分離コロニーを接種します。エアインキュベーター内の組織培養ローテーターで曝気しながら、37°Cで一晩インキュベートします。
2. 一晩の培養の_OD600を測定します。OD₆₀₀の測定値を取得する前に培養物を洗浄し、培地中に存在するピオメラニンを排除します。
3. 16,000 x gの微量遠心分離機で1 mLの培養物を2分間遠心分離して培養物を洗浄し、上清と緩くペレット化された細胞をマイクロピペットで除去し、固体細胞ペレットを1 mL LBに再懸濁します。
4. 翌日、酸化ストレッサーとしてH₂O₂を含むLB寒天プレートを準備します。0〜1 mMのH₂O₂濃度の範囲が適切な開始点です。
   1. LB寒天フラスコを溶かします。媒体を室温で約50°Cに冷却します。
   2. H₂O₂を冷却された媒体に所望の濃度で直接加える。渦巻きフラスコを混ぜます。H₂O₂の濃度と添加する濃縮H₂O₂の量については、表1を参照してください。これらの値は、100 mlのLB寒天に基づいています。
   3. H₂O₂を加えた直後にプレートを注ぎ、表面を炎で覆って気泡を取り除きます。収率は、LB寒天100mlあたり4プレートです。プレートにH₂O₂濃度を印
   印します。
   4. カバーされていないプレートを生物学的フローフードに入れ、ファンを30分間作動させて、プレートから余分な水分を取り除きます。
      手記：プレートは準備したその日に使用してください。そうしないと、データの一貫性が失われる可能性があります。
      手記：パラコートなどの酸化ストレッサーは、このアッセイでH₂O₂の代わりに使用できます。他の酸化ストレッサーに使用される濃度は、H₂O₂に使用される濃度とは異なる場合があります。
5. 一晩培養した_OD600を洗浄して測定します。
6. すべての一晩培養のOD₆₀₀を、試験対象の菌株セットの最低値に正規化します。緑膿菌は、LBで一晩培養した場合、一般にOD600は約2.5です。
   1. 総容量1 mLで培養物を最低_OD600に希釈するために必要な培養物の量を決定します。たとえば、カルチャーの OD₆₀₀ が 3 で、菌株セットの最小 OD₆₀₀ が 2.5 の場合、(2.5)(1 ml) = (3)(x) の計算を実行します。X = 0.833 mL 0.833 mLの培養物をマイクロチューブに入れます。
   2. 培養量を1 mLにするために必要なLB + DMSOの量を計算します。ステップ4.4.1の例では、培養物に添加するLB + DMSOの量は0.167 ml(総容量1 ml – 培養液0.833 ml)になります。これらの希釈に使用するLB + DMSOのストック溶液を、すべての菌株の希釈に必要な量に基づいて作成します。
   3. 培養物とLB+DMSOをボルテックスで混合します。
7. 培養物を一定濃度のDMSOに維持するには、PBS + DMSOで正規化したオーバーナイト培養物を10倍段階希釈します。
   1. PBS+DMSOのストックソリューションを作ります。1株の希釈液1セットに対して、300 μMの容量のDMSOをPBSと混合すると、合計容量が720 μlになります。これらのストックは、テストする菌株の数に応じてスケールアップまたはスケールダウンします。
   2. マイクロフュージチューブを^10-1から^10-7の段階希釈液に標識します。90 μlのPBS + DMSOを適切なチューブに加えます。LB + DMSOで成長した株にはPBS + DMSOを使用してください。
   3. 10 μlの培養物を適切な^10-1希釈チューブに加えます。ボルテックスで混合し、^10-1希釈液10μlを^10-2希釈チューブに移します。すべての希釈が実行されるまで繰り返します。希釈間でピペットチップを交換します。
8. ^10-3から^10-7の希釈液のうち5 μlをLB + H₂O₂プレート上に各系統ごとに重複して配置します。スポットが最も希釈されているものから最も希釈されていないもの(^10-7から^10-3)に播種されている場合は、1つのピペットチップを使用してください。液体がプレートに乾くまで、プレートを傾けたり傾けたりしないでください。
9. プレートを37°C(エアインキュベーター)で24〜48時間インキュベートします。株によって異なります.
   注:緑膿菌PAO1は、24時間のインキュベーション後にLBに適切なサイズのコロニーを持つことになります。PAO1とほぼ同じサイズのコロニーを持つまで、菌株をインキュベートします。
10. トランスルミネーターの上でCCDカメラを使用してプレートを撮影します。必要に応じて、写真のコントラストを編集し、同じサイズに切り抜きます。各スポットのコロニー数を数え、酸化ストレスに対する感受性の変化を判断します。

>表 1: 酸化ストレス スポット プレート アッセイのために LB 寒天に添加する H₂O₂ の濃度。 この表は、さまざまな H₂O₂ 濃度と、100 ml LB 寒天培地に添加する濃縮 H₂O₂ ストックの対応する量を示しています。

日

H2O2 の最終濃度 (mM)	9.79MH2O2(30%重量)を添加する量(μl)
0	0
0.2	2.04
0.4	4月09
0.6	6.13
0.8	8.17
1	10月21日

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)	シグマ・アルドリッチ	SML0269-50mg	ニチシノンとも呼ばれます。DMSOに可溶です。
H2O2	シグマ・アルドリッチ	216763から100ミリリットル	H2Oで30重量%。安定 化。