ブロス中のマイコバクテリアに対する試験化合物の有効性の評価

要約

出典:Zheng, X., et al. System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、結核菌に対する抗生物質の有効性を決定するためのブロス内アッセイを示しています。細菌培養物は、異なる濃度の殺菌性抗生物質とインキュベートされます。殺菌効果は、レサズリンアッセイを使用して生存細菌の存在を評価することによって測定されます。

プロトコル

1. 細菌株と増殖培地

1. 25 gのウシ血清アルブミン、10.0 gのデキストロース、および4.05 gの塩化ナトリウムを460 mLの脱イオン水に可溶化することにより、アルブミンデキストロースと塩ストック溶液(ADS)を作成します。.ADSをフィルター滅菌し、4°Cで保存します。
2. 精製水900mLに7H9粉末4.7gとグリセロール2mLを加えて7H9ブロスを作ります。7H9ブロスを121°Cで10分間オートクレーブし、室温まで冷ましてから進めます。100 mLのADSと0.5 mLのTween80 to 900 mLの7H9ブロスを加えて7H9ADSTを作成します。4°Cで保存してください。
3. 50 mg の硫酸カナマイシンを秤量し、1 mL の脱イオン水に溶解すると、最終濃度は 50 mg/mL になります。フィルター滅菌し、-20°Cで保存し、7H9ADST.
   1 Lあたり0.5 mLのカナマイシンストック溶液を加えます。 手記：この培地は新鮮にする必要があるため、培養サイズに応じてボリュームを適切にスケーリングします。
4. 7H9ADSTで結核菌を増殖させ、立位培養でカナマイシンを補充します。毎日培養物を振って、OD₆₀₀が1.0に達する前に希釈して凝集を防ぎます。
   手記：この方法の開発に用いた結核菌株は、H37RvにpJAK2.Aプラスミドを形質転換した。pJAK2.Aは、pMV361ベクターをベースとした統合プラスミドで、hsp60プロモーター由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子を高レベルで発現させることができ、カナマイシンを用いて選択することができます。

2. レサズリンアッセイを用いたブロス内活性解析

1. 7H9ADSTで結核菌を中対数期(~0.5 - 0.8 OD600)まで成長させます。7H9ADSTで培養物を0.01 OD₆₀₀に希釈します。7H9ADSTで化合物を試験濃度の2倍に希釈し、希釈した各化合物の100μLを各ウェルに分注します。
2. 希釈した細菌懸濁液100μLを各ウェルに移します。プレートを加湿インキュベーターで37°Cで5日間インキュベートします。10 mgのレサズリンを100 mLの脱イオン水と滅菌フィルターに溶解します。.
3. 30 μL のレサズリン溶液を添加し、48 時間後の色の変化をモニターすると、細菌の増殖は青色からピンク色への色変換によって示されます。
   手記：定量分析は、590 nmの蛍光と530〜560 nmの励起、または570 nmおよび600 nmの吸光度を測定することによっても実行できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミドルブルック7H9	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	271210
トゥイーン80	フィッシャーサイエンティフィック	T164
アルブミン、ウシpH7	アフィメトリックス	10857
葡萄糖	フィッシャーサイエンティフィック	BP350
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP358
硫酸カナマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP906
レサズリン	アルファ・アエサル	B21187
グリセロール	フィッシャーサイエンティフィック	BP229
結核菌H37Rv
96ウェル平底ホワイトプレート	コーニング	3917
95ウェル平底クリアプレート	コーニング	3595
透明プレートシーラー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AB-0580
ルミノメーター	応用バイオシステム	トロピックス TR717

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