PBMCと共培養したX線照射上皮細胞におけるTEERの測定

要約

出典:Babini, G., et al.X線を照射したCaco-2細胞とPBMCとの間のクロストークを調査するための共培養法。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、PBMC細胞の存在下と非存在下の両方で、照射されたCaco-2細胞における経上皮電気抵抗の測定を示しています。この方法により、放射線と免疫細胞が上皮細胞バリアに及ぼす相乗効果の研究が可能になります。

プロトコル

1. 照射セットアップ

>注:Caco-2細胞の照射は、さまざまな種類の癌の治療に日常的に使用されている線形加速器を使用して、Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico(IRCCS)S.Maugeri(イタリア、パヴィア)の放射線治療部門で行われました。

1. 光子X線エネルギーを6MVピークに設定します。線形加速器は、パルス領域(2つの連続したパルス間の時間は約4ミリ秒、1つのパルスの持続時間は約5μs、線量率は最大1 × ^10-3 Gy/p)で動作します。
2. Caco-2 のインサートを含む 6 ウェルプレートを、放射線源から 100 cm の位置にある厚さ 1.4 cm のプレキシガラス シート (使用した放射線の蓄積よりわずかに大きい距離に対応) 上の X 線の軌道上に置きます。
3. 照射が行われる前に、各サンプルに厚さ0.5cmのボーラスを配置して、後方散乱放射線成分と荷電粒子の平衡を確保します。
4. 細胞(2〜10Gyの範囲の線量)に、平坦で対称的な(± 2%)20 x 20 cm₂の放射線野と3 Gy/min.
   の線量率で照射します。 手記：対照「偽」放射線を照射した細胞は、照射室に入らずに、照射された細胞と同じ処置条件を受けました(被曝線量:0Gy><)。 注意：電離放射線発生装置は、専門の担当者のみが使用する必要があります。

2. 経上皮電気抵抗 (TEER)

1. 照射の1週間前に、6ウェルプレート共培養インサート(ポリエチレンテレフタレート(PET)、2 x 10⁶細孔/cm2)に5 × 10^{5 Caco-2}細胞を播種します。
2. 照射の1時間前に、電圧計/抵抗計でTEERを測定します。
3. ステップ1.1〜1.4の説明に従って細胞に照射します。
4. 5% CO₂ を含む加湿雰囲気中で、PBMC との共培養の存在下/非存在下で 37 °C で Caco-2 細胞をインキュベートします。
5. 照射後最初の数時間は、1時間ごとにTEERを測定し、その後は3時間ごとに最大48時間
測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マルチウェルプレート用 ThinCert 6 ウェル細胞培養インサート	グライナーバイオワン	657610	備品
細胞培養マルチウェルプレート、6ウェル	グライナーバイオワン	657160	プラスチック
細胞培養マルチウェルプレート、24ウェル	グライナーバイオワン	662160	プラスチック
RPMI 1640 (L-グルタミンなし	ロンザ	12-167階	試薬
ミリセル-ERS電圧計/電圧計	ミリポア	MERS00001	備品

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