抗菌剤をスクリーニングするためのペグプレートバイオフィルムアッセイ

要約

出典:Dalecki, A. G., et al. Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、ペグプレートを使用してバイオフィルムを効率的に除去する抗菌化合物をスクリーニングするアッセイを示しています。この方法論は、抗菌化合物で処理した後のバイオフィルムの代謝状態をモニターし、バイオフィルムの最小根絶濃度の決定を容易にします。

プロトコル

1. バイオフィルムの開始

1. バイオフィルムを産生する生物の培養物を、栄養豊富な培地で培養します。黄色ブドウ球菌株Newmanをグリセロールストックから10 mlのMueller-Hinton培地に接種します。黄色ブドウ球菌の取り扱いを含むすべての作業は、手袋を着用し、バイオセーフティキャビネット内で行ってください。
2. ロータリーシェーカー(100-200 rpm)で37°Cで16時間インキュベートします。
3. 分光光度計と標準キュベット(光路長:1cm)を使用して、培養物のOD₆₀₀を測定します。
4. ロズウェルパーク記念研究所のメディア(CRPMI)でOD_{600(接種物)}が0.1の20mlの接種物を調製するために必要な培養物の量(V)を、式[V = 20 ml * 0.1 / OD_600(培養)]を使用して計算します。
   1. 計算した培養量(上図)を遠心チューブに加え、10,000 x gで1分間回転させて細胞をペレット化します。バイオフィルム接種物を調製するには、使用済みの増殖培地を吸引し、細胞ペレットを20 mLのCRPMIに再懸濁します。
5. 接種材料を25mlのリザーバーに注ぎます。
6. 滅菌済みの96ウェルペグプレートをまっすぐ上に引っ張って、蓋を慎重に取り外します。
   注意: 蓋からぶら下がっているペグを汚染しないように注意する必要があります。蓋は、バイオセーフティキャビネット内の清潔な表面に逆さまに置くことができます。
7. 200 μlのマルチチャンネルピペットを使用して、底板のA列からG列の各ウェルに125 μlの接種材料を加えます。
8. 無菌コントロールとして、125 μLの滅菌CRPMI培地を列Hの各ウェルに充填します。
9. ペグの蓋を取り、ペグを下に向けてプレートの底の上に持ちます。個々のペグをそれぞれのウェルに慎重に位置合わせします。プレートとペグの間の物理的な接触を避けてください。位置が合ったら、蓋を慎重に下げます。ペグが底板に触れた後に行われた再調整は、列Hの無菌制御を汚染する可能性があるため、ミスアライメントを避けてください。
10. プレートに蓋をパラフィンフィルムで密封して蒸発を防ぎ、密封可能なビニール袋に入れてしっかりと密封します。蒸発を最小限に抑えるために、バッグ内の空気量をできるだけ低く保ちます。
5
11. % CO₂インキュベーターで37°Cで48時間振とうせずにインキュベートします><。 注:黄色ブドウ球菌にとって48時間の成長が最適ですが、使用する生物によって異なります。
    手記：静的インキュベーションはアッセイを最適化するための良い出発点ですが、マイクロプレートシェーカーで150rpmで穏やかに振とうすると、一部の黄色ブドウ球菌分離株のバイオフィルム形成を促進する可能性のあるバリエーションです。

2. バイオフィルムチャレンジプレートの準備

1. バイオフィルムチャレンジの当日は、新鮮な96ウェルプレートを取り、RTに平衡化したCRPMI100μlをB列からH列の各ウェルに加えます。一貫性のない結果を避けるために、ペグが内側にあるときに200 μlの培地を保持でき、バイオフィルム開始プレートと同じ寸法のウェルを備えた96ウェルプレートを使用してください。
2. ステップ 2.7.
   での最終希釈を考慮するために、最大 4 つの試験化合物を 1.0 ml の CRPMI で別々に希釈し、希望の最終濃度の 2 倍にします 注:プランクトン細胞の阻害濃度より8倍高いところから始めるのが適切です。
3. 200 μlの化合物1をウェルA1からA3に、化合物2をウェルA4からA6に、化合物3をウェルA7からA9に、化合物4をウェルA10からA12に添加します。
4. マルチチャンネルピペットを使用して試験化合物を段階希釈し、100 μlを列Aから列Bに移して混合します。
5. そのようにして、100μlをウェルからウェルに転写し続けます。各転送後に混合し、列Fで停止します。
6. 混合後、F列から100μlを廃棄物容器に排出します。G列とH列に液体を移さないでください。
7. マルチチャンネルピペットを使用してプレートの各ウェルに100 μlのCRPMIを加え、容量を200 μlにします。最終的なプレートレイアウトについては、図1を参照してください。

>3. バイオフィルムチャレンジ

1. 200 μlのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を、バイオフィルム開始プレートと同じ寸法のウェルを備えた新鮮な滅菌96ウェルプレートに加えます。
2. インキュベートしたバイオフィルム開始プレートからビニール袋とパラフィンフィルムを取り出します。
3. 蓋をまっすぐ持ち上げます。ペグとプレートの底部が接触すると、バイオフィルムが損傷する可能性があるため、避けてください。底部は、後続の OD₆₀₀ 解析 (3.8 を参照) のために保持します。
4. PBSを含むプレートにペグ蓋を置いて、浮遊細胞を洗い流します(ステップ3.1から)。ペグを5秒間沈め、PBSから持ち上げて、ペグを井戸の側面にぶつけないように注意しながら、もう一度沈めます。
5. すすいだペグの蓋をチャレンジプレートに入れます。ペグと底板の間の不必要な接触は、バイオフィルムを損傷し、一貫性のない結果につながるため、避けてください。
6. プレートをパラフィンフィルムで密封し、手順1.10の説明に従って密封可能なビニール袋に入れます。
7. プレートを振とうせずに、5% CO₂インキュベーターで37°Cで24時間インキュベートします。
8. バイオフィルム開始プレートの底を3.3から取ります。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルの細菌を再懸濁し、適切なマイクロプレートリーダーでOD₆₀₀を測定して、すべてのウェルで発生している増殖を確認しますが、行Hの無菌制御は維持されています。

4. バイオフィルムの決定

1. インキュベーションチャンバーが装備され、レサズリン変換を検出するための速度論的蛍光測定値を取ることができるプレートリーダーを使用してください。530 nmの励起と590 nmの発光を使用して、24時間の動的蛍光測定を設定します。
2. チャンバー温度を37°Cに設定し、プレートを20分ごとに読み取ります。
3. 滅菌済みの96ウェルプレートに、マルチチャンネルピペットで200 μlのPBSを加えて、洗浄プレートを調製します。
4. 400 μl の 0.8 mg/ml レサズリン原液を 20 ml の CRPMI 培地に加え、最終濃度 16 μg/ml のレサズリン (
   ) まで調製します 手記：レサズリンは皮膚刺激性があることで知られています。取り扱いの際は、白衣、スプラッシュゴーグル、手袋を使用してください。バイオフィルム回収媒体としてのCRPMIは、バックグラウンドシグナルが最も低いため使用されましたが、必要に応じてMueller Hinton培地に置き換えることができます。
5. 150 μlのバイオフィルム回収培地とマルチチャンネルピペットを、新鮮な96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
6. チャレンジプレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移し、ビニール袋とシーリングフィルムを慎重に取り外します。
7. チャレンジプレートからペグの蓋を取り外し、3.4で説明されているようにPBSのプランクトン細胞を洗い流します。チャレンジプレートの底部は、その後のOD₆₀₀解析(4.10参照)のために保管しておいてください。
8. すすぎ後、バイオフィルム回収培地が入ったプレート底にペグ蓋を置きます。
9. プレートの側面をパラフィンフィルムで包み、周囲のウェルの底を遮らないように注意してください。プレートを包んだ直後に、プレートリーダーに置き、ステップ4.1から以前に作成したレサズリンキネティックプロトコルを開始して、24時間にわたってキネティックリードを開始します。
10. チャレンジ中に発生する可能性のあるプランクトン細胞の増殖を定量化するには、マイクロプレートリーダーを使用してチャレンジプレート底部全体のOD₆₀₀を読み取ります。手順 3.8.
    の指示に従います 注:バイオフィルムから脱落した細胞はウェルの底に塊状に成長する傾向があるため、各ウェルの内容物を慎重に再懸濁してください。ウェル内の気泡は_OD600の読み取りに強く干渉するため、読み取り前に回避または除去する必要があります。

結果

図 1.チャレンジプレートのレイアウト。4つの化合物を6つの異なる濃度で三重に並行試験できるチャレンジプレートのレイアウト例。未処理の無菌管理も含まれています。レイアウトデザインは、マルチチャンネルピペットを使用した段階希釈液のインプレート調製に便利です。濃度はμMです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミューラー・ヒントン・ミディア	オキソイド	CM0405	メーカーの推奨に従ってください
RPMI-ミディアム	コーニング	17-105-CV
CRPMIの	リファレンス 9		RPMI-1640 ミディアム chelex 100 樹脂で 1 時間硬化させた後、10% 未硬化の RPMI-1640 を補充
Chelex 100 レジン	バイオ・ラッド	〒142-2822
MBECプレート	インノボテック	19111年
レサズリンナトリウム塩	シグマ	R7017	800 μg/ml in DI 水フィルター
マイクロプレート振とうプラットフォーム	ハイドルフ タイトラマックス1000
Cytation 3 プレートリーダー	ビオテック
Gen5ソフトウェア	ビオテック		レサズリン変換の記録と解析
ネオクプロイン	シグマ	N1501	100%エタノールで10 mMストックを調製し、-80°Cで保存
硫酸銅	アクロスオーガニックス	7758-99-8	100 mMの原液を水に調製し、4°Cで保存
Cu-ネオクプロイン	自力		ネオキュプロインと硫酸銅の等しいモル濃度を混合することによって生成されます。混合物をCRPMI培地で所望の濃度に希釈した。
ゲンタマイシン	シグマ	G3632-1Gの

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