原形質膜の再封止効率を測定するためのin vitro蛍光ベースのアッセイ

要約

出典:Lam, J. G., et al. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、哺乳類細胞における原形質膜の再封鎖効率を研究するためのアッセイを示しています。細胞は細菌の細孔形成毒素にさらされ、細胞膜に細孔を形成します。細胞外カルシウムイオンの存在下では、細孔がカルシウムの流入を引き起こし、膜の再封入イベントを誘発します。再封止効率は、DNA結合性ヨウ化プロピジウム色素を用いて評価されますが、これは再密封された膜がない細胞にのみ入ります。

プロトコル

1. 準備

1. セルめっき
   手記：このプロトコルでは、ヒト子宮頸部上皮細胞であるHeLaおよびHistone 2B-GFP(H2B-GFP)を発現するHeLaを使用しましたが、このアッセイは他の哺乳動物細胞にも適用できます。
   1. 75 cm²細胞培養フラスコから接着細胞を2 mLのトリプシン-EDTA 0.25%で洗浄して、接着細胞を剥離します。使用済みのトリプシンを2mLの新鮮なトリプシン-EDTA 0.25%と交換します。
   2. 細胞が丸くなり、フラスコから分離するまで、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
   3. 細胞を8 mLの増殖培地(10%熱不活化ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むDMEM)に再懸濁します。
   4. 血球計算盤と10 μLの細胞懸濁液を使用して細胞濃度を測定します。
   5. 増殖培地で細胞を2.5 x 10⁵細胞/mLの濃度に希釈します。
   6. 細胞懸濁液を滅菌ピペット洗面器に注ぎ、10 mLの血清ピペットを使用して懸濁液を完全に混合します。
   7. 12チャンネルマイクロピペットと200 μLチップを使用して、HeLa細胞(2.5 x 10⁴細胞/100 μL/ウェル)を3重(または四重)に、96ウェル平らで透明な底の黒色ポリスチレン組織培養プレートに分配します
      手記：めっきの配置を例として図1に示します。
   8. 加湿細胞培養インキュベーターで細胞を37°Cおよび5%CO₂で24時間培養します。
2. 原液調製
   1. 95 gのHanks Balanced Salt Solution、0.476 gのMgCl₂(5 mM)、および23.83 gのHEPES(100 mM)を900 mLの水に加えて、10倍ストックのバッファーM(M1およびM2の調製に使用)1 Lを調製します。pHを7.4に調整し、容量を1Lに上げます。
   2. 50倍(1.25 M)のグルコースストック50 mLを調製し、11.26 gのD-(+)-グルコースを合計50 mLの水に加えます。溶液をろ過滅菌します。
   3. 100倍(120 mM)のカルシウムストック50 mLを調製し、0.666 gのCaCl₂を合計50 mLの水に加えます。溶液をろ過滅菌します。
   エ
   4. チレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N',N', 四酢酸(EGTA)の10倍(50 mM)ストック50 mLを調製し、40 mLの水に0.951 gのEGTAを加えます。NaOHを使用してpHを8に上げてEGTAを溶解し、容量を50mLに上げます。溶液をろ過滅菌します。
   5. 96ウェルプレート1枚につき、Medium 1(M1、Ca²⁺を含む)50 mL、Medium 2(M2、Ca²⁺-free)50 mL、およびEGTAを添加したMedium 2 15 mLを調製します。
      1. M1の場合、10x Buffer Mを5 mL、100x CaCl₂を0.5 mL、50xグルコースを1 mLを43.5 mLの水に加えます。
      2. M2の場合、44 mLの水に5 mLの10x Buffer Mと1 mLの50xグルコースを加えます。
      3. M2/EGTAの場合、12 mLの水に1.5 mLの10x Buffer Mと1.5 mLの10x EGTAを加えます
         手記：ヨウ化プロピジウム(PI)を含むすべての溶液は、細胞に添加する直前に調製する必要があります。
3. プレートリーダー/イメージングサイトメーターの設定
   手記： 分光蛍光光度計とイメージングサイトメーターの2つの検出ユニットを備えたマルチモードプレートリーダーを使用してください。蛍光色素の光退色を避けるために、蛍光曝露を制限してください。
   1. アッセイを実行する前に、プレートリーダーを37°Cに予温します。
   2. 設定モードでキネティックアッセイのパラメータを適宜設定します。
      1. 光学構成、読み取りモード、読み取りタイプにそれぞれモノクロメーター、FL (蛍光)、およびキネティックを選択します。
      2. [Wavelength Settings]で、9 nmと15 nmの励起バンドパスと15 nmの発光バンドパスをそれぞれ選択します。ヨウ化プロピジウム(PI)を使用するアッセイでは、励起波長と発光波長をそれぞれ535 nmと617 nmに設定します。
      3. [プレート タイプ] で、プレート形式として [96 ウェル] を選択し、黒壁の透明な底板に対応する事前設定されたプレート構成を選択します。
      4. [読み取り領域] で、キネティック全体で分析されるウェルを強調表示します。
      5. [PMT and Optics] で、読み取りあたりのフラッシュ数を 6 にプリセットし、[Read from Bottom] のチェックボックスをオンにします。
      6. [Timing] で、30 分間のキネティックアッセイの場合は [Total Run Time] ボックスに 00:30:00 を挿入し、[Interval.
         ] に 00:05:00 を挿入します。 注:各時点と 1 つの波長について、フル 96 ウェルプレートの読み取り時間は 30 秒です。
      7. 右側の[設定情報]で指定した設定を確認し、[OK]を選択します。 Readを押して、キネティックランを開始します。
   3. 設定モードでイメージングパラメータを適宜設定します。
      1. 光設定、読み取りモード、読み取りタイプにそれぞれ [Minimax]、[Imaging]、および [Endpoint] を選択します。
      2. [波長] で、透過光を選択し、456/541 nm (GFP) と 625/713 nm (PI) の励起波長と発光波長に対応する蛍光ボックスのいずれかまたは両方を選択します。
      3. [プレート タイプ] と [読み取り領域] には、手順 1.3.2.3 と 1.3.2.4 で定義したのと同じオプションを使用します。
      4. [Well Area Setting] で、画像化する井戸内のサイトの数を選択します。
         注:12サイトがフルウェル画像に対応しています。
      5. [Image Acquisition Settings]で、透過光の露光時間、541(GFP)、および713(PI)を選択します。GFPの場合、20 ms/imageの露光時間でウェル全体をイメージングします。透過光(TL)蛍光とPI蛍光の場合、露光時間がそれぞれ8ミリ秒と20ミリ秒の露光時間で、各ウェルの中心の1つの画像を取得します。
      6. 右側の[設定情報]で指定した設定を確認し、[OK]を選択します。96ウェルプレートの各ウェルの全表面(12画像/ウェル)を1波長でイメージングする取得時間は~15分です。Readを押してイメージングを開始します。
         注:96ウェルプレートの1つの画像/ウェルの取得時間には、1波長で~2.5分/プレートが必要です。上記のパラメータは、当研究室の特定の機器に対応しています。分光蛍光測定:1.0 nm刻みの励起波長(250-850 nm)を表示するキセノンフラッシュランプで、9または15 nmのバンドパスを調整可能で、> 6 logのダイナミックレンジを持つ光電子増倍管検出器、および15または25 nmの発光バンドパスを調整可能です。イメージングサイトメーター:白色光、460 nm、625 nmの励起波長、20 nmのバンドパス、541 nm(108 nmのバンドパス)と713 nm(123 nmのバンドパス)を中心とする発光フィルター、および1.25メガピクセルの12ビット電荷結合デバイスカメラに結合された4倍対物レンズを備えた照明光源。

2. アッセイ

>注:アッセイ時には、細胞は70〜90%コンフルエントでなければなりません。洗浄ステップでは、培地をウェルの側壁(細胞の真上ではなく)から取り出して適用する必要があります。LLOの温度を<4°Cに維持して、ステップ3.1.5までLLOの凝集を防ぎます。

1. M1に30 μM PIのストックを、37°Cに予熱したM2に30 μM PIのストックを準備します。
2. 次のように、12チャンネルマイクロピペットと200 μLチップを使用して、プレート1の細胞を穏やかに洗浄します。
   1. 修復許容条件の場合は、増殖培地を取り出し、37°Cで予熱した200μL/ウェルM1で細胞を2回洗浄します。培地を30μMのPIを含む100μL/ウェルの温かいM1と交換します。
   2. 修復制限条件の場合は、増殖培地を取り出し、細胞を5 mM EGTAを含む200 μL/well warm M2で細胞を1回洗浄してCa²⁺をキレート化し、続いて200 μL/well M2で1回洗浄します。培地を、30 μM PIを含む100 μL/温厚なM2と交換します。
   3. 増殖培地を洗浄し、ヨウ化プロピジウムを含む培地と交換した後、直接ステップ2.1.3に進みます。
3. 透過光、GFP、およびPI下でのイメージプレート1は、1.3.3(プレキネティック)で詳述されています。このステップには15〜20分かかります。
4. ステップ 2.1.3 の 15 分間で、12 チャンネルマイクロピペットと 200 μL チップを使用して、次のようにプレート 2 を調製します。
   1. 96ウェルの丸底ポリプロピレンマイクロプレートを氷の上に置きます。プレート1(図1)に対応する実験計画を使用してプレートを構成します。
   2. 修復許容条件の場合は、60 μM PIを含む氷冷M1を100 μL/ウェル追加し、続いて4x LLOを含む氷冷M1を100 μL/ウェル
   追加します。
   3. 修復制限条件の場合は、60 μM PIを含む氷冷M2を100 μL/ウェル追加し、続いて4x LLOを含む氷冷M2を100 μL/ウェル追加します。
5. プレート1をイメージングした後(ステップ2.1.3)、すぐに氷の上に置き、アルミホイルを使用してプレートが氷と直接接触しないようにします。プレート1を5分間冷まします。
6. 12チャンネルマイクロピペットと200 μLチップを使用して、各ウェルから100 μLをプレート2に移し(ステップ2.1.4)、プレート1の対応するウェルに移します。プレート1の媒体に毒素を適切に分配するには、先端を半月板の下に挿入し、泡を導入せずにボリュームを静かに排出します
   注:ピペットで上下に動かすと、誤って細胞が剥がれる可能性があるため、ピペットで動かさないでください。
7. 毒素が細胞に結合するのを待つためにプレートをさらに1分間放置し、すぐにプレート1をプレートリーダーに移し、分光蛍光光度計モード(ステップ1.3.2)を使用したキネティックアッセイを行います。
8. キネティックアッセイの最後に、ステップ1.3.3を使用してプレート1(ポストキネティック)を直ちに画像化します。

3. 分析: セル列挙

1. マイクロプレート細胞計数ソフトウェアを使用して、核蛍光に基づいて細胞数を決定します。
   1. [設定]で[再分析]を選択し、[画像分析設定]内のカテゴリセクションで、オブジェクトを見つけるための波長として541を使用したディスクリートオブジェクト分析を選択します。
   2. 「オブジェクトの検索」オプション内で、「画像に描画」検索方法を使用して、「設定」タブの「Nuclei」を選択し、「適用」を押します。
   3. [OK]と[Read]を押して、セルカウントアルゴリズムを開始します。

結果

図1:実験計画。フロー図は、制御された未処理細胞と比較して、7つの試験条件の影響をテストするように構成された代表的なプレート設計を示しています。必要に応じて、たとえば麻薬車両などの追加の制御を含める必要があります。細胞は、実験の24時間前にプレーティングされます(プレート1)。実験当日は、プレート1の細胞を37°Cに予め加温したM1またはM2培地で洗浄し、プレートをプレキネティックでイメージング(TL、GFP、PI蛍光)します。15分間のイメージング中に、試薬を氷上からプレート2に添加します。イメージング後、プレート1を直ちに氷上に5分間置き、100μL/ウェルをプレート2からプレート1に移します。プレート1をプレートリーダーにセットして、37°Cで30分間キネティックアッセイを実行した後、イメージング(TL、GFP、およびPI蛍光)を行います。次に、データを分析して細胞をカウントし、すべての実...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー	分子デバイス	i3xの
MiniMax 300 イメージングサイトメーター	分子デバイス	5024062
TO-PRO-3	サーモフィッシャーサイエンティフィック	T3605
ヨウ化プロピジウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P3566
ヘラ	ATCCの	CCL2
ヘラH2B-GFP	ミリポア	SCC117
トリプシン-EDTA 0.25%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200056
96ウェルコーニング平底黒色ポリスチレン組織培養処理プレート	コーニング	3603
ハンクスのバランス塩	シグマ・アルドリッチ	H4891-J
エグタ	ISCバイオエクスプレス	0732-100グラム
ヘープス	フィッシャーサイエンティフィック	BP310-500
D-(+)-グルコース、HybriMax	シグマ・アルドリッチ	G5146-1KG

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