狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色

要約

出典:Niezgoda, M. et al., Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、感染したマウス脳組織における狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色を示しています。このプロセスには、脱パラフィンとアルコール処理が含まれ、その後、抗原のアクセシビリティを強化するためのタンパク質分解処理が行われます。免疫組織化学染色では、赤色の沈殿物が明らかになり、組織切片に狂犬病抗原が存在することが確認されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 組織のホルマリン固定

1. 剖検後に採取した3〜5mmの脳組織を10%リン酸緩衝ホルマリン溶液(1:20〜1:50組織/ホルマリン比)に24〜72時間
   注意：ホルマリンは有毒な固定剤です。
2. ホルマリンのおおよその組織重量(サイズ)、組織の種類(脳領域)、および体積を記録します。ラボでは、固定時間に関する記録を文書化し、維持することが重要です。
3. ホルマリン固定後および処理前に組織をより長く保存するには、組織を70%エタノールに入れます。

2. 組織処理

1. 標本の固定後、組織を解剖して、脳幹、小脳(3つの葉)、または海馬(両方の海馬)の断面など、重要な脳領域を含め、それぞれ3〜5 mmの厚さにカットして処理カセットに入れます。
2. パラフィンワックス浸潤用の組織カセットを処理し、パラフィンブロックに埋め込み、ミクロトーム上に切片化(3〜6μm)します。

>3. 材料の準備/皿の染色

1. 染色皿(材料表)を図1に示すように設置します。各皿に250mLの溶液を入れます。
2. 3-アミノ-9-エチルカルビゾール(AEC)基質ストック溶液の調製
   1. ガラスピペットを使用して、3-アミノ9-エチルカルバゾール(AEC)の20 mg錠剤1錠を5 mLのN、N、ジメチルホルムアミドに溶解します。
      注意：AECは発がん性物質です。
3. 抗原賦活化のためのプロテアーゼ(プロナーゼなど)原液の調製
   1. 7 mgのプロテアーゼを200 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解します。
4. リンスバッファーPBS-Tの調製
   1. 10 mLのTween、80〜990 mLのPBSを加えます。よく混ぜて均質な溶液を形成します。

4. 脱パラフィンと組織の再水和

1. ミクロトームを用いて5μmのパラフィン切片を作製し、38°Cのウォーターバスに浮かべてスライドガラスに集めます。スライドに試薬耐性のあるペン/マーカーでラベルを付けます。
2. スライドをトレイに置き、55〜60°Cのオーブンで1時間溶かします。60°C以上に温度を上げると、ウイルス抗原が破壊される可能性があるため、使用しないでください。
3. オーブンからスライドを取り出し、すぐに皿1、2、および3でそれぞれ5分間の3回連続キシレンすすぎで脱パラフィンします。
4. エタノールの希釈を脱イオン水に減少させるように連続的に浸漬することにより、スライド上のセクションを再水和します:(4〜11はディップリンスです)ディッシュ4:キシレン/ 100%エタノール(1:1);ディッシュ5:100%エタノール;ディッシュ6:100%エタノール;ディッシュ7:95%エタノール;ディッシュ8:95%エタノール;ディッシュ9:80%エタノール;ディッシュ10:70%エタノール;ディッシュ11: 脱イオン水(図1。ディッシュセットアップ).
   注意：キシレンは危険な化学物質であり、作業はドラフト内で行う必要があります。

5. タンパク質分解抗原賦活化

1. スライドをプロテアーゼ(2.5 μg/mLのPBS)で30分間処理し、ディッシュ12でタンパク質分解性抗原賦活化を行います。
2. 次に、PBS-Tで10分間すすぎます(ディッシュ13)。
3. 3%過酸化水素で10分間処理します(ディッシュ14)。
4. 再度、PBS-Tで10分間洗浄します(ディッシュ15)。

6. 染色手順

1. スライドを一度に1つずつ取り扱って、残りのスライドをバッファーに沈めたままにします(スライドホルダー全体を取り外さないでください-スライドを濡らしてください)。スライドを1枚取り出し、ティッシュ切片を乱さないように注意しながら、ティッシュ切片の周囲から余分なバッファーを(ペーパータオルを使用して)拭き取ります。湿らせたペーパータオルを実験室のベンチトップに室温で、通常のヤギ血清(ブロッキング)を入れた湿度チャンバーでスライドをインキュベートします(ブロッキング)。
2. 最適な希釈液の一次抗狂犬病抗体(マウス抗狂犬病血清の1:250希釈、未発表)(ポジティブコントロール)およびネガティブコントロール抗体と、上記と同じ室温(ステップ6.1)で、洗浄を挟まずに60分間インキュベートします。
3. 60分後、PBS-Tで10分間洗浄します(ディッシュ16)。
4. ビオチン化抗体(種特異的)と室温で湿度チャンバー内で15分間インキュベートします(ステップ6.1と同じ取り扱い)。
5. PBS-Tで10分間洗浄します(ディッシュ16)。
6. ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体と室温で15分間インキュベートします(取り扱いは6.1と同じです)。
7. PBS-Tで10分間洗浄します(ディッシュ16)。
8. ペルオキシダーゼ基質であるアミノエチルカルバゾール(AEC)と室温で10分間インキュベートし、使用直前にAECを調製します。これを行うには、1 mLのAECストック溶液を14 mLの0.1Mアセテート緩衝液(pH 5.2)に加えます。0.15mLの3%過酸化物、H₂O_{2を加えます}。使用直前に混合物をろ過します(0.45μmフィルター).
   手記：AECの作業溶液は2〜3時間しか安定していません。AECストック溶液は、冷蔵庫で長期間保存できます。
9. 脱イオン水で10分間洗浄します(ディッシュ17)
10. Gill's Hematoxylin で対比染色し、脱イオン水で 1:2 に希釈して 2 分間 (ディッシュ 18)。
11. 脱イオン水ディップリンスリンス(ディッシュ19および20)で余分なヘマトキシリンを洗い流します。
12. スコットの水道水で30秒間すすぎます(ブルーイングソリューション)皿21。
13. 脱イオン水で10分間洗浄します(ディッシュ22)
14. スライドを1枚ずつ取り外し、水溶性の封入剤で埋込します。
15. 光学顕微鏡でスライドを読み取ります。

結果

図1:IHC試験のさまざまな手順を示すフローチャート。 

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3%過酸化水素	Pharamacyブランド		既製品 3% H2O2
3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)	ミリポアシグマ	A6926の
アセテートバッファー pH 5.2	ポリサイエンティフィックR&Dコーポレーション	S140
緩衝ホルマリン10%リン酸緩衝液	フィッシャーサイエンティフィック	SF100-4	折り紙付き
カバースリップコーニング	フィッシャーサイエンティフィック	12-553-471	24 X 50ミリメートル
エタノール190プルーフ	Pharmco-AAPERの	111000190
エタノール200プルーフ	Pharmco-AAPERの	111000200
ギルのヘマトキシリン製剤#2	フィッシャーサイエンティフィック	CS401-1Dの
HistoMarkビオチン-ストレプトアビジンペルオキシダーゼキット	セラケア	71.00.18	マウス一次抗体
イムノヒストマウント	ミリポアシグマ	I1161	封入剤
N,N, ジメチルホルムアミド GR	フィッシャーサイエンティフィック	D119
リン酸緩衝生理食塩水	ハイクローン	01 RR14440月	01M、pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95対物レンズ	複数のベンダー
平面アポクロマティック 20X/0.75 対物レンズ	複数のベンダー
プロナーゼ	ミリポアシグマ	53702	プロテアーゼ、Streptomyces griseus
スコットの水道水	ポリサイエンティフィックR&Dコーポレーション	S1887
Tissue-Tek スライドステインセット	フィッシャーサイエンティフィック	50〜294〜72
トゥイーン-80	ミリポアシグマ	P1754
キシレン	フィッシャーサイエンティフィック	X3S-4	組織学的グレード
Zeiss Axioplan 2 イメージング - 顕微鏡	複数のベンダー