マクロファージと浸潤した免疫細胞との関係を研究するための免疫組織化学

要約

出典:Albano-Aluquin, S. et al., 巨細胞動脈炎における葉酸受容体ベータマクロファージと血管免疫微小環境をプロファイリングするための免疫組織病理学的研究。J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、側頭動脈生検で浸潤した免疫細胞集団全体におけるマクロファージの相対的な比率を定量化する手法を示しています。自己免疫疾患に罹患した組織切片を免疫組織化学的に染色すると、免疫細胞を特異的な受容体で選択的に染色し、他の細胞と視覚的に区別します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 側頭動脈生検後の病理組織学的準備と処理

注:側頭動脈生検(TAB)は、認定された外科医によって局所麻酔および無菌条件下で行われます。より影響を受けた側に3cmの動脈切片を外科的に取得した後、標本を直ちにホルマリンで24時間固定し、3〜4mmの切片に分割し、パラフィンに埋め込みます。検体選抜は、カルテを確認した上で行います。診断は、1990年の米国リウマチ学会の基準に基づいており、被験者は5つのドメインのうち3つを満たす必要があります:年齢>50歳、新たな頭痛、側頭動脈の圧痛、ウェスターグレン法による赤血球沈降速度>50mm/時、および異常なTAB。 安全のために、標本を取り扱うときは常に保護手袋を着用する必要があります。 化学物質、および抗体。

1. 埋め込まれたブロックから、厚さ4〜5 μmの切片をミクロトームで切断し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色します。品質保証のために、選択した正常組織のコントロール切片を使用してください。
2. 40°Cに加熱した温水浴で切片を浮かせ、シワを取り除き、コーティングされた顕微鏡ガラススライドで拾い上げます。スライドガラスを60°Cのオーブンで60分間温めたプレートに置き、乾燥とスライドへの付着を促進します。
3. スライドガラスを60°Cのオーブンで60分間温めたプレートに置き、乾燥とスライドへの部分の接着を促進します。
4. 顕微鏡スライドに3つの切片をマウントします。
5. スライドを縦置きのラックに置き、37°Cで一晩24時間乾燥させます。
6. スライドを容器に入れ、4°Cで保存します。

2. 免疫組織化学の調製、脱ロウ、抗原賦活化、染色

1. スライドをスライドラックにロードします。次のようにラックを皿に通します:100%キシレンで5分間2回、30秒ごとに10秒間の穏やかな攪拌、100%エタノールで10秒間の攪拌で1回、90%エタノールで10秒の攪拌で1回、70%エタノールで10秒間の攪拌で1回、2回、10秒間の攪拌で_H2Oを2回攪拌します。
   手記：キシレンとアセトンの取り扱いは、吸入や呼吸器毒性を避けるために、換気されたフードで行う必要があります。.
2. 200 mLの10 mmol/L、pH 6.0クエン酸緩衝液を95°Cに予熱したガラス容器にラックを移し、水浴でタイマーを30分セットし、室温で20分間冷却し、流水で5分間すすいでください。
3. 200 mLの3%過酸化水素で10分間インキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼ活性を除去します。スライドを200 μLのトリス緩衝生理食塩水(TBSS)で3回洗浄します。
4. スライドをラックから取り外し、スライドを1枚ずつ軽くたたいて余分なバッファーを拭き取ります。染色には、以下の一次抗体を200 μL加え、スライド上にカバーガラスを添加し、室温で1時間湿潤チャンバー内でインキュベートします:
   抗葉酸受容体β(FRB)抗体を1:800に希釈
   モノクローナルマウス抗ヒトCD68、1:200希釈
   ポリクローナルウサギ抗CD3 1:100希釈
   手記：ホルマリン固定パラフィン包埋切片もステップ2.1から2.9で概説したように処理し、抗FRB18とインキュベートし、ポジティブコントロールとして使用しました。染色結果は、最適な抗体濃度を見つけることによって得られ、抗体を二重希釈(例:1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600)で滴定することによって行いました。
5. インキュベーション後、カバースリップをはがして廃棄します。スライドをTBSSで2分間ずつ3回すすぎ、水気を切り、余分なバッファーを拭き取ります。
6. ビオチン化抗ウサギ/マウス二次抗体を含む二次抗体溶液200 μLを添加し、組織抗原に結合した非標識一次抗体と反応させます。カバースリップをスライドに置き、湿ったチャンバーで室温で45分間インキュベートします。
7. インキュベーション後、カバースリップをはがして廃棄します。スライドをTBSで各2分間3回すすぎ、水気を切り、余分なバッファーを拭き取ります。
8. ジアミノベンジジン(DAB)+基質バッファー(イミダゾールHCl)-発色剤システム200 μLを加え、10分間インキュベートして染色パターンを可視化します。TBSSで洗い、水道水で10分間流します。
9. ヘマトキシリンで3分間対比染色します。
10. スライドの表面に70μLの封入剤を塗布してスライドをマウントします。カバースリップを封入剤の上にゆっくりと傾け、所定の位置に下げるときに気泡が発生しないようにします。乾くまで24時間待ちます。

3. 病理組織学的および免疫組織化学的(IHC)解析

光学顕微鏡を使用して、GCA陽性および正常な被験者のH&EおよびIHC染色切片を調べます。

1. H&E染色切片用
   1. 血管構造を評価し、内膜の内皮細胞、中膜の平滑筋細胞、および外膜の線維芽細胞と血管
   血管を特定します。
   2. リンパ球およびマクロファージ/組織球の浸潤、細胞過形成、および内部弾性ラミナの分解を含むGCAの特徴を特定します。
   3. リンパ球に対するマクロファージの数を同定し定量化することにより、リンパ組織球浸潤を分析します。内部弾性薄層破壊の程度と常在細胞の過形成性変化を評価し、それらを対照と比較します。
2. IHC染色切片用
   1. 特定の種類の細胞による発現、血管層内の分布、全免疫浸潤、総マクロファージマーカー、抗CD68、および汎リンパ球マーカーの抗CD3との関係に注意して、FRBの染色パターンを調べます。
   2. FRB、CD68、および CD3 細胞の発現を定量化するには、10 個の無作為に選択されたハイパワーフィールド (hpf) で陽性に染色された細胞をカウントし、その平均を記録します。 (
      手記： これらの正常細胞および病理学的細胞および構造の同定は、認定された循環器病理医およびリウマチ専門医によって行われ、その結果はすべての症例について記録されました。
   3. デジタルカメラで代表的な画像を撮影する.
      注:これらの手順の後、残りのアリコートは-80°Cで保存できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミクロトーム	ライヒェント・ユング
無地およびつや消しの顕微鏡スライドとカバースリップ	フィッシャー・サイエンティフィック
縦型ラック	フィッシャー・サイエンティフィック
光学顕微鏡	オリンパスBX60顕微鏡
キシレン
蒸留水中のアセトン			濃度 100%、90%、70%
トリス緩衝生理食塩水 (TBS)	ダコウォッシュバッファーS3006
TBS
ジアミノベンジジン (DAB)	シグマファストタブレットセット
ケミカルパーマウント封入剤	フィッシャー・サイエンティフィック	SP-15-100
ハーレコ ギルズ III ヘマトキシリン	ファイシャー・サイエンティフィック 23-750-019
ハーレコ エオシン Y 1% アルコールストック溶液	フィッシャー・サイエンティフィック	23-749-977
10 mM クエン酸一水和物 (pH 6.0)
ポリクローナルウサギ抗葉酸受容体β	マノハル・ラトナム		は1:800
モノクローナルマウス抗ヒトCD68	ダコ	M071801	1:200
ポリクローナルウサギ抗CD3	アジレント・ダコ	A0452	1:100
高分子ヤギ抗ウサギ/マウス二次抗体	ダコ
胎盤組織			FRBポジティブコントロール用

の 3% 過酸化水素 で最適化 で最適化 で最適化