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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 組織採取とUV架橋
- 二酸化炭素(CO2)を使用して2匹の成体マウスを1〜2分間、または呼吸が止まるまで安楽死させます。次に、各マウスで頸部脱臼を行います。
- 免疫沈降実験ごとに、適切な年齢のマウス(この研究では1つの成体精巣)から約100mgの精巣を採取し、組織を氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます。
- ツニカ・アルブギネアを1組の細いピンセットでそっと取り除きます。
- ティッシュグラインダーに氷冷したPBS3 mLを加え、緩いガラス乳棒(タイプAガラス乳棒)を使用して穏やかな機械的力で組織を粉砕します
注:このステップの目的は、細胞を溶解することではなく、組織を引き離すことです。細胞の生存率と完全性の維持は重要です。
- 組織懸濁液を細胞培養皿(直径10 cm)に移し、氷冷したPBSを最大6 mLまで加えます。
- 液体が皿の底を均一に覆うように、皿をすばやく振ってください。組織が適切に粉砕されている場合、均一に分布した精細管が見えますが、組織の塊の存在は、組織の分散が最適ではないことを示しています。
- 氷上で254nmで400 mJ / cm2でサスペンションを3回架橋します。各照射間に懸濁液を混合します.
手記：新しい実験ごとに、架橋を最適化する必要があります。
- 懸濁液を15 mLの円錐チューブに集め、ペレットを1,200 x gで4°Cで5分間採取し、上清を除去し、ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、懸濁液を1.5 mLの遠心チューブに移します。4°C、1,000 x gで2分間遠心し、上清を除去します。
- この時点で、すぐに残りのプロトコルに進むか、ペレットを液体窒素で急速冷凍し、使用するまで-80°Cで保存します。
2. ビーズの準備
- サンプル(ペレット)あたり125μLのプロテインA磁気ビーズを新鮮な遠心分離チューブに加えます.
手記： マウス抗体にはプロテインG磁気ビーズを使用します。
- チューブを磁石に置き、ビーズを溶液から分離します。10秒後、上清を取り除きます。氷冷溶解バッファー1mLでビーズを2回洗浄します
手記：その後のプロテインA磁気ビーズの分離は、このステップに続きます。溶解バッファーの組成は 50 mM Tris-HCl、pH 7.5;100 mM NaCl;1%NP-40;0.1%のSDS;0.5%デオキシコール酸ナトリウム;1/50エチレンジアミン四酢酸(EDTA)フリープロテアーゼ阻害剤カクテル(新鮮なものを追加)。
- 100 μLの冷解緩衝液にビーズを10 μgのeCLIP抗体と共に再懸濁します。チューブを室温で45分間回転させます.
手記：免疫沈降のための最終抗体濃度は10 μg/mLです。抗体濃度が不明な場合は、抗体の量を最適化する必要があります。
- ビーズを氷冷溶解バッファー1mLで2回洗浄します。
3. 組織溶解と部分RNA消化
- 組織ペレットを1 mLの冷溶解バッファーに再懸濁します(22 μLの50x(EDTA)フリータンパク質阻害剤カクテルと11 μLのRNase阻害剤を1 mLの溶解バッファーに加えます)。
- 実験グループごとに2つのUV架橋ペレットと2つの非架橋ペレットを再懸濁します:eCLIPライブラリ用のUV-架橋-1ペレット(UV-1);eCLIPライブラリ用のUV架橋-2ペレット(UV-2)。コントロールとしてのeCLIPライブラリ用の非架橋-1ペレット(非UV);抗体の特異性を実証するためのIgG IP用の非架橋2ペレット.
手記： UV架橋ワイドタイプ精巣のeCLIPライブラリーの理想的なコントロールは、同じ同腹児のマウス由来のUV架橋ノックアウト精巣のコントロールです。
- サンプルを氷上で15分間溶解し続けます(タンパク質とRNAの分解を防ぐため)。
- デジタルソニケーターで10%の振幅で5分間、30秒オン/30秒オフで超音波処理します。常にサンプルを氷の上に置き、各サンプルの間にヌクレアーゼフリーの水でプローブを洗浄します。
- 各チューブに4 μLのDNaseを加え、よく混合します。1,200 rpmで振とうしながら、37°Cで10分間インキュベートします。
- 希釈したRNase I(PBS中のRNase Iは4 U/μL RNase I)10 μLを加え、よく混合します。1,200 rpmで振とうしながら、37°Cで5分間インキュベートします。
- ライセートを15,000 x gで20分間(4°C)遠心分離して透明
化します。
- 上清を慎重に集めます。50 μLのライセートを残し、ペレットを廃棄します。
- インプットサンプルをRWB(ウェスタンブロット用)およびRRI(RNA単離用)として保存します。UV-1、UV-2、非UV、およびIgGサンプルの20 μL(2%)をRWBゲルローディングの入力として保存します。RRIゲルローディングのインプットとして、UV-1またはUV-2サンプルを20 μL(2%)保存します。
4. 免疫沈降
- 1 mLのライセート(ステップ3.7)をビーズ(セクション2で調製)に加え、サンプルを4°Cで2時間または一晩回転させます。
- ビーズを磁気スタンドで集め、上清を捨てます。ビーズを900 μLの高塩緩衝液(50 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 M NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40、0.1% SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム)で2回洗浄し、次に900 μLの洗浄緩衝液(20 mM Tris-HCl、pH 7.5、10 mM MgCl2、0.2% Tween-20)でビーズを2回洗浄します
手記：IgGサンプルの場合は、ここで手順を一時停止し、洗浄バッファーの氷上に保存します。