抗原特異的CD8+ T細胞の細胞周期解析のためのアッセイ

要約

出典:Simonetti, S., et al. A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T cells in Vaccinated Mice. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、さまざまな細胞周期の段階で抗原特異的なCD8⁺ T細胞を分析するためのアッセイを示しています。蛍光標識された生細胞は、フローサイトメトリーを使用して選択され、細胞増殖関連核タンパク質に対する抗体と核酸染色剤を使用して、さまざまな細胞周期段階の細胞をDNA含量によって識別します。

プロトコル

1. 培地と染色液の調製

1. 完全な培地を調製する:2 mMグルタミン、100 U / mLペニシリン/ストレプトマイシン、50 μMベータメルカプトエタノール、および10%の体積/体積(v / v)のウシ胎児血清(FBS)を含むロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)培地
2. 染色緩衝液の調製:Ca²⁺/Mg²⁺(PBS)を含まないリン酸緩衝生理食塩水、1%重量/体積(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)および2 mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩(EDTA)

>2. マウスの扱い

1. ヒト免疫不全ウイルス (HIV)-1-gag-発現-チンパンジー アデノウイルス ベクター (ChAd3-gag) の大腿四頭筋に 10⁷ ウイルス粒子の用量で筋肉内 (i.m.) 注射による、生後 7-8 週齢の雌 Balb/c マウス。
2. プライミング後1〜4ヶ月で、HIV-1-gag-発現改変ワクシニアアンカラウイルス(MVA-gag)のi.m.注射によりマウスを10⁶プラーク形成単位の用量で一旦ブーストします。
3. ブースト後3日目に、ブーストされたマウスを子宮頸部脱臼によって犠牲にし、未治療のマウスと並行して分析します。
4. 大腿四頭筋(腸骨、膝窩、鼠径部)と脾臓を排出するリンパ節(LN)を、ブーストマウスと未治療マウスから採取します。さらに、未治療のマウスから2本後肢から骨髄(BM)を採取し、このBMをフローサイトメーターの設定や細胞周期解析のポジティブコントロールとして使用します(図1)
   手記：前述のように、ChAd3-gag ベクトルと MVA-gag ベクトルを生成します。

3. 排水LN、脾臓の分離

1. 脾臓細胞とLN細胞の単離
   1. 2本の15 mLチューブのそれぞれに5 mLの完全培地を置き、氷上に置いて臓器を採取する準備をします。
   2. 成体マウスを頸部脱臼で犠牲にします。
   3. マウスを仰向けに置き、70% v / vエタノールで皮膚表面を滅菌します。
   4. 鼠径部のLNを採取するには、ハサミで腹部に~1cmの縦切開を行い、鉗子で切開部を伸ばします。
   5. 皮膚の内面に鼠径部のLNを可視化し、鉗子で採取します。ステップ 3.1.1 で調製した 2 つの 15 mL チューブのいずれかに鼠径部 LN を入れます。
   6. 脾臓を採取するには、ハサミで腹膜切開を行い、脾臓を切除します。周囲の結合組織を切断した後、ステップ3.1.1で調製した2番目の15mLチューブに脾臓を入れます。
   7. 腸骨LNを採取するには、腸を脇に動かして下大静脈付近の腸骨LNを可視化し、鉗子を使って採取します。腸骨LNを鼠径部のLNs.
      手記： 染色に十分な量のLN細胞を得るために(セクション4を参照)、1匹のマウスから膝窩LN、鼠径LN、腸骨LNをプールする必要があることがよくあります。これらのLNはすべて大腿四頭筋(i.m.ワクチン接種の部位)を排出しています。このプロトコールでは、プールされたLNの15 mLチューブを1本のみ使用します。
   8. 膝窩LNを採取するには、後肢の皮膚をつかみ、ゆっくりと下に引っ張って筋肉を露出させます。次に、膝関節の下の筋肉の間に鉗子を挿入し、膝窩LNを採取します。膝窩LNを鼠径部と腸骨のLNを含む同じチューブに入れます。
      手記： 3.1.7 以降の注を参照してください。
   9. 脾臓を、5 mLの完全培地で満たされた60 mmの培養皿内の70 μmの細胞ストレーナーに入れます。5 mLシリンジプランジャーを使用して、臓器が完全に分解するまで優しくつぶします。
   10. ストレーナを取り外し、細胞懸濁液を清潔な15 mLチューブに移します。
   11. 培養皿に5mLの完全培地を加え、すべての細胞が回収されたことを確認するために、皿とストレーナーを注意深く洗います。残りの脾臓細胞懸濁液を15mLチューブにプールします。
   12. プールされた鼠径部、腸骨、および膝窩のLNについては、脾臓のステップ3.1.9から3.1.11で使用したのと同様の手順に従って、シングルセル懸濁液を調製します。
   13. 細胞を400 g×g、4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットをPBSに再懸濁します。
   14. 赤血球溶解バッファーとPBS中の0.04%v/vトリパンブルーを使用して、ノイバウアーチャンバーで細胞をカウントします。

>4. 脾臓の染色、LN

1. 染色する細胞サンプルを3つのサブグループに分けます:Hoechst 33342(以下、Hoechstと呼ぶ)のみで染色される未処理マウスのBM細胞を含む補償用の細胞サンプル、および死細胞色素補償のための死細胞/生細胞ミックスを調製するために使用される未処理マウスの脾臓細胞。未処理マウスのBMサンプルからなる細胞周期解析のポジティブコントロール。未治療およびワクチン接種済みマウスの脾臓およびLNサンプルを含む実験サンプル.
   手記：十分な数のギャグ特異的CD8 T細胞を解析するのに十分な脾臓細胞とLN細胞があることを確認してください。多くの場合、3匹のワクチン接種マウス由来のプール脾臓細胞およびプールLN細胞を使用し、それぞれが3個×10個の⁶細胞を含むプール細胞の2つ以上の同一サンプルを染色する必要があります。Hoechst染色のステップで同一のサンプルをマージします。同様に、未処理のマウス3匹のプールした脾臓細胞とLN細胞を染色し、最後に同一のサンプルをマージします。未処理のマウスから採取した未染色の脾臓細胞のサンプルを、装置およびコンペンセーションのセットアップに使用するために取っておきます。
2. 死細胞色素の補償のために死細胞/生細胞ミックスを調製します(この細胞の混合物は、死細胞色素でのみ染色されます)。
   1. ウォーターバスを65°Cで加熱します。
   2. 脾臓細胞のアリコートを取ります(~3 × 10⁶)。
   3. 細胞懸濁液をマイクロチューブに移し、65°Cのウォーターバスに5分間入れた後、すぐに氷上に10分間置きます。
   4. 加熱死滅させた細胞と生きた脾臓細胞(~3 × 10⁶)を1:1の比率で混合し、混合物の半分を96ウェルラウンドボトムプレート(~3 × 10⁶細胞/死細胞染色コントロール用)に移します。
3. 実験サンプルの死細胞染色、細胞周期解析のポジティブコントロール、および死細胞/生細胞ミックス
   1. 染色スキーム(ステップ4.1)に従って、脾臓、LN、BM細胞(3 × 10⁶細胞/ウェル)、および死細胞/生細胞混合物(セクション4.2)を96ウェル丸底プレートに移し、400 × gで4°Cで3分間遠心分離します。
   2. 各細胞ペレットをPBSで希釈した50 μLの死細胞色素に再懸濁し、すぐに3回ピペットで上下させて再懸濁します。
   3. 4°Cで30分間インキュベートし、光から保護します。
   4. 細胞を染色バッファーで2回洗浄し、1回目は200 μLで、2回目は250 μLで洗浄します。各洗浄で、プレートを400 × gで4°Cで3分間遠心分離します。
   5. 上清を捨て、細胞ペレットを20 μLのPBSに再懸濁します。
4. 主要組織適合遺伝子複合体(MHC)-ペプチドマルチマーおよびモノクローナル抗体(mAb)による膜細胞染色。
   1. 染色スキーム(フローサイトメーターの設定、表1)に従って必要な量を考慮して、以下の試薬を調製します。
      1. mAbを染色バッファー中で適切な希釈度に従って2.4G2希釈します(「材料表」を参照)。染色するサンプルごとに、この希釈液を10 μL使用します。
         注:2.4G2 mAbは、免疫グロブリンのFcγIIIおよびFcγII受容体への非抗原特異的結合をブロックします。
      2. H-2k(d) AMQMLKETI アロフィコシアニン(APC)標識四量体(Tetr-gag)を染色バッファーで希釈し、適切な希釈液(材料表を参照)を得ます。染色するサンプルごとに、この希釈液を20 μL使用します。
      3. 滴定実験で事前に決定された適切な希釈率(Table of Materials(材料表)を参照)に従って、染色バッファー中でmAbsを希釈することにより、抗体ミックスを調製します。染色する各サンプルにつき、この抗体ミックスを20 μL使用します。
         手記：ここでは、抗CD3eペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP-Cy5.5)(クローン145-2C11)、抗CD8a高輝度紫外線(BUV805)(クローン53-6.7)、および抗CD62Lフィコエリトリンシアニン7(PECy7)(クローンMEL-14)を使用しました。
   2. 以前に希釈した2.4G2 mAbを10μL加え(ステップ4.4.1.1)、光から保護した状態で4°Cで10分間インキュベートします。
   3. あらかじめ希釈しておいたTetr-gag APC(ステップ4.4.1.2)20 μLとH-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrin(PE)ペンタマー(ペントギャグ)10 μLを加えます。光から保護して、4°Cで15分間インキュベートします。
   4. あらかじめ調製した抗体ミックス20μLを添加し(ステップ4.4.1.3)、光から保護された状態で4°Cで15分間インキュベートします
      手記：したがって、最終容量はウェルあたり80μLです(ステップ4.3.5、ステップ4.4.2〜4.4.4)。
   5. 細胞を200 μLの染色バッファーで洗浄します。400 g× gで4°Cで5分間遠心分離します。
   6. 細胞ペレットを250 μLの染色バッファーに再懸濁し、細胞懸濁液を5 mLチューブに移します。1 mLの染色バッファーをチューブに加え、400 × gで4°Cで5分間遠心分離します。
   7. Hoechstチャネル(Hoechst 33342は紫外線レーザーによって励起される（フローサイトメーターの設定（表2））)を補償するために使用するBM細胞（33342×10⁶細胞））(細胞サンプルのリスト、セクション4.1を参照)のアリコートを取り、細胞懸濁液を5mLチューブに移します。1 mLの染色バッファーをチューブに加え、400 × gを4°Cで5分間遠心分離します。

>5. 固定/透過化

1. メーカーの指示に従って、固定/透過濃縮液1部を3部の固定/透過希釈液で希釈することにより、新しい固定/透過化緩衝液を調製します。
2. 上清を捨て、サンプルをパルスボルテックスしてペレットを完全に分解します。
3. 未染色の脾臓細胞(3 x 10⁶、細胞サンプルのリスト、セクション4.1を参照)が入ったチューブを含む、調製したばかりの固定/透過化バッファー1 mLを各チューブに加え、ボルテックスします。
4. 4 °C.
   で16時間インキュベートします。 手記： ここでプロトコルを一時停止できます。

6. 細胞内染色

1. Ki67染色
   1. 製造元の指示に従って、透過化バッファーを蒸留水で10倍に希釈することにより、新鮮な透過化バッファー1倍を調製します。使用前に、透過化バッファー1xを0.45μmフィルターでろ過し、凝集体を除去する必要があります。
   2. mAb Ki67フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(クローンSolA15)を、滴定実験で以前に決定したように、透過化バッファー1x(材料表を参照)で希釈します(サンプルあたり最終容量100 μL
   )。
   3. 3 mLの透過化バッファーを各チューブに1回加え、室温(RT)で400 × gで5分間遠心分離します。
   4. 上清を捨てて、手順6.1.3を繰り返します。
   5. 上清を捨て、細胞ペレットを100 μLの以前に希釈したmAb Ki67 FITCに再懸濁します(ステップ6.1.2)。
   6. 光から保護して、室温で30分間インキュベートします。
   7. 細胞を4mLの透過化緩衝液で2回1回洗浄します。各洗浄について、400 × gでRTで5分間遠心分離します。
   8. 次の容量を考慮して、細胞ペレットをPBSに再懸濁します:フローサイトメーターで直接取得するサンプルには350 μLのPBS、フローサイトメトリーの直前にHoechstでインキュベートするサンプルには250 μLのPBS(セクション6.2)。
2. DNA染色
   1. PBS中の4 μg/mL Hoechstを250 μLずつ各サンプルに加えます(Hoechstの最終濃度は2 μg/mL><)。 注:PBS中の250 μLの同一サンプルを2つ以上調製した場合は、このステップでそれらを融合し、PBS中に等量の4 μg/mL Hoechst溶液を加えます(Hoechstの最終濃度は2 μg/mLです)。細胞の数はDNA染色ステップに大きく影響します。各サンプルで同じセル番号を使用します。細胞数がわずかに減少した場合でも(例えば、以前の洗浄ステップでの細胞損失による)、DNAへのHoechst結合が高くなり、Hoechst強度が高くなることに注意してください。
   2. 光から保護した室温で15分間インキュベートします。
   3. サンプルを400 × gでRTで5分間遠心分離します。
   4. 細胞ペレットを350μLのPBSに再懸濁します。

>7. コンペンセーションビーズサンプルの作製

1. 染色バッファー中のmAbを適切に希釈して、抗体5 μLを調製します
   手記： 実験で使用した蛍光色素標識モノクローナル抗体ごとに、対応するコンペンセーションビーズサンプルを調製します。
2. ボルテックスネガティブコントロールと抗ラット/ハムスターIg、κコンプビーズ使用前に
。
3. 各サンプルについて、ネガティブコントロールコンプビーズを1滴(~20 μL)と抗ラット/ハムスターIg,kコンプビーズを1滴導入します。
4. 希釈した抗体5 μLをチューブに加え(ステップ7.1)、ピペで上下します。
5. 光から保護して、4°Cで15分間インキュベートします。
6. サンプルを2 mLの染色バッファーで洗浄します。400 g× gで4°Cで5分間遠心分離します。
7. 上清を捨て、各チューブとボルテックスに500μLのPBSを加えてペレットを再懸濁します。

8. 装置とコンペンセーションのセットアップとフローサイトメーターでの実験サンプル取得

>注:サイトメーターの設定については、フローサイトメーターの設定(表2)を参照してください。

1. 一般的な装置と補正のセットアップ
   1. サンプル取得用のソフトウェアを開き(材料の表を参照)、ワークスペースリボンセクションの「New Experiment」をクリックし、「New Blank Experiment」を選択して、新しい実験を作成します。
   2. 作成した実験をダブルクリックして開きます。
   3. Cytometer Settings(サイトメーター設定)ウィンドウで、Parameters(パラメータ)をクリックし、前方散乱光(FSC)およびサイドスキャッター(SSC)パラメータを含む、染色パネルで使用されるすべてのチャネル(PE、APCなど)を選択します。
   4. Log Scaleのチェックを外してHoechstパラメータとして線形スケールを選択し、FCS、SSC、Hoechstの電圧パルスの幅(W)を確認します
      手記：デフォルトでは、すべてのパラメータは対数(対数)スケールで表示されますが、FSCとSSCは線形スケールで表示されます。すべてのパラメータは、電圧パルスの面積(A)と高さ(H)によって分析されます。
   5. グローバルワークシートで、X軸にFSC-A、Y軸にSSC-Aのドットプロットを作成します。
   6. 未染色の脾臓サンプルを、Acquisition DashboardのAcquisition Dataをクリックして分析します。
   7. 適切なFSCおよびSSC設定を行い、パラメータセクションの電圧値を変更してセルを可視化し、グローバルワークシートのワークスペースツールバーのポリゴンゲートをクリックして、FSC-A/SSC-Aドットプロットに表示されているすべてのセルを選択するゲートを作成します。
   8. ゲート細胞をヒストグラムに表示し、各蛍光パラメータをx軸上に表示します。
   9. 未染色および完全に染色された脾臓サンプルを泳動して、蛍光検出器(PMT)を調整し、各蛍光パラメータについて染色細胞の負シグナルと陽性シグナルが明確に分離
   されるようにします。
   10. 報酬設定を実行するには、ワークスペース リボンの 実験 をクリックし、報酬設定 セクションで 報酬コントロールの作成 を選択します。Include Unstained Control Tube/Well のチェックを外し、OKをクリックします。
       手記：この操作により、Compensation Controlsという名前の試験片と、選択した各パラメータに対応する複数のシートを含むNormal Worksheetが作成されます。
   11. コンペンセーションビーズのサンプルを実行し(セクション6を参照)、適切なFSCおよびSSC設定を行い、CytometerウィンドウでFSCパラメータの電圧値と取得しきい値5,000を変更して
   ビーズを視覚化します。
   12. ビーズポピュレーションのP1ゲートを調整し、正と負の両方のピークがx軸に表示されていることを確認します。各コンペンセーションビーズサンプルに対してこの操作を繰り返し、最後にAcquisition DashboardのRecord Dataをクリックして各サンプルファイルを記録します(サンプルごとに少なくとも5,000のイベントを記録します)。
   13. 記録されたビーズサンプルごとに、P2ゲートとP3ゲートをそれぞれ正と負のピークに設定します。
   14. セルサンプルをコンペンセーションのために実行します(ステップ4.2と4.4.7、およびセクション5と6を参照)。FSCおよびSSC電圧としきい値を変更してセルを視覚化し、P1ゲートを調整し、最後に各サンプルファイルを記録します(少なくとも10,000イベントを記録します)。P2 ゲートと P3 ゲートをそれぞれ正と負のピークに設定します。
       手記：Hoechstチャネルの補償には、負のピーク(P3)としてG₀/G₁を使用し、正のピーク(P2)としてG₂/Mを使用します。
   15. ワークスペースのリボンセクションで「実験」をクリックし、「報酬設定」セクションで「報酬の計算」を選択します。
   16. 作成した補正設定に名前を付け、リンクして、現在の実験に保存します。
2. 実験サンプル取得
   1. ブラウザツールバーの「新規試料」をクリックして試料を開き、グローバルワークシートでゲーティング戦略を作成します。
      手記：サンプル取得のゲーティング戦略は、図2およびセクション9で説明したサンプル分析のゲーティング戦略と似ています。
   2. すべてのイベント母集団を CD3-A を X 軸にヒストグラムで表示します。CD3⁺細胞のみを選択するInterval Gateを作成します。
   3. Acquisition Dashboard で、LN サンプルの場合は All Events として Storage Gate を、脾臓サンプルの場合は All Events または CD3⁺ cells として選択します。
   4. 実験サンプルを低速で実行し、最後にすべてのファイルを記録し、ワクチン接種したマウスから各サンプルごとに少なくとも100〜200個の抗原特異的CD8 T細胞を収集するようにします><。 手記： 実験サンプルのファイルサイズは通常大きく(30〜120 MB)、特に抗原特異的CD8 T細胞の頻度が低い場合です。したがって、少なくとも100〜200個の抗原特異的CD8 T細胞を記録するためには、多数のイベント(> 1 × 10⁶)を収集する必要があります。大きなファイルを使用すると、その後のデータ分析プロセスが遅くなる可能性があります。脾臓サンプル中のCD3⁺細胞のみを取得する(上記のステップ8.2.2を参照)ことは、ファイルサイズを小さく保つのに役立ちます。
   5. 細胞周期解析のためのポジティブコントロール、すなわち未処理マウスのBMサンプルを実行し、記録します。

>9. データ分析

1. ソフトウェアを開き(材料の表を参照)、ワークスペースリボンセクションの[グループの作成]をクリックして、分析するさまざまな臓器に対応するさまざまなグループを作成します(つまり、グループ「a-LNs」、「b-spleen」、「c-BM」を作成します)。
   手記： 新しく作成されたグループはグループリストに表示され、「補償」グループはソフトウェアによって自動的に生成されます。
2. グループ名をダブルクリックして [Modify Group] ウィンドウを開き、新しく作成したグループが同期されていることを確認します。そうでない場合は、関数 Synchronized にチェックマークを挿入します。
3. 各 .fcs ファイルを対応するグループにドラッグします。
4. 「a-LNs」グループから開始するゲート戦略を作成します。
5. グループ内の完全に染色されたサンプルをダブルクリックしてグラフウィンドウを開くと、x軸とy軸はfcsファイルと同様にラベル付けされます(フローサイトメーターの設定、表2を参照)。
6. このサンプルで集録されたイベントの合計を、x軸にDNA-A、y軸にDNA-Wのドットプロットで表示します。
7. グラフウィンドウのゲーティングツールセクションで長方形をクリックして、単一セル母集団のみを選択します。
   手記：単一細胞のDNA-A値は、2N(低):2Nから4N(中)、または4N(高)に等しい、一方、DNA-W値はそれらすべてで同一です(図2のステップ1)。
8. 長方形のゲートの中央をダブルクリックすると、x 軸に FSC-A パラメータ、y 軸にデッドセル色素を持つ 1 つのセルがドットプロットに表示されます。
9. グラフウィンドウのゲーティングツールセクションでPolygonをクリックして、生細胞集団のみを選択します。生細胞は死細胞色素に対して陰性です(図2のステップ2)。
10. ポリゴンゲートの中央をダブルクリックすると、x 軸に FSC-A パラメータ、y 軸に SSC-A パラメータを持つドットプロットにセルが表示されます。
11. Rectangleをクリックし、そのグラフ内のすべての単一の生細胞を含む「リラックスした」ゲートを作成します(図2のステップ3)。
12. 「リラックス」ゲートの中央をダブルクリックすると、CD3がx軸に、CD8がy軸にドットプロットでセルが表示されます。
13. 「Polygon」をクリックして、CD3⁺CD8⁺セルを選択します(図2のステップ4)。
14. CD3⁺CD8⁺ゲートの中央をダブルクリックすると、x軸にTetr-gag、y軸にPent-gagのドットプロットでセルが表示されます。
15. Polygon(図2のステップ5)をクリックして、抗原特異的CD8 T細胞(Tetr-gagとPent-gagの両方に陽性)を選択します。
16. ギャグ専用ゲートの中央をダブルクリックすると、x軸にDNA-A、y軸にKi67のドットプロットで細胞が表示されます(図3)。
17. グラフウィンドウのゲーティングツールセクションでQuadをクリックして、異なる細胞周期フェーズの細胞を選択します。
    手記： G₀期の細胞はKi67neg-DNA低細胞です(左下の象限)。G₁の細胞はKi67pos-DNAが低くなっています(左上の象限)。S-G2/Mの細胞はKi67pos-DNA中間体/高細胞(右上象限)です(図3)。
18. 1 つのサンプルで作成されたゲート戦略を対応するグループにコピーして、グループのすべてのサンプルにゲートを適用します。
19. 「a-LN グループ」に対して手順 9.5 から 9.18 を繰り返します。
20. すべてのゲートが「b-spleen」グループの各サンプルに適していることを確認してください。BM細胞間の細胞周期を解析(ポジティブコントロール)するには、「リラックス」ゲートの中央をクリックして、x軸にDNA-A、y軸にKi67のドットプロットで細胞を表示します。
21. すべてのゲートが 3 つのグループの各サンプル (つまり、脾臓、LN、および BM の細胞) に適していることを確認します。
    手記：シングルセルポピュレーションゲート(ステップ9.7)と細胞周期のクワッドゲート(ステップ9.17)は、主にサンプル間のHoechst色素強度のわずかな違い(セクション6.2)により、異なるサンプルで異なるゲート座標を持つ場合があります。このため、各サンプルの細胞周期のシングルセルポピュレーションゲートとクワッドゲートを変更する必要がある場合があります。これは次のように行われます:グループ名をダブルクリックし、グループのプロパティから同期を削除します。この操作により、グループの他のすべてのサンプルで同じゲートを変更することなく、1つのサンプルのゲートを変更できます。同期の削除後、必要に応じてゲートを変更します。
22. この解析によって得られた結果を視覚化するには、ワークスペースリボンセクションの[Layout Editor]をクリックして開きます。サンプル ペインのゲーティング ストラテジの各ゲートをレイアウト エディターにドラッグし、ゲーティング ストラテジーのシーケンスに従ってプロットを配置します。必要に応じて、レイアウト内の対応するプロットをダブルクリックし、[グラフ定義]ウィンドウで適切な[タイプ]を選択して、グラフのタイプを変更します。
23. レイアウトリボンの「Group and iterate by」関数をクリックして、各臓器で得られた結果を視覚化し、異なるサンプルを比較します。

>表1:フローサイトメーターの設定。

見本	抗体パネル
フルステイン済み	キ67 FITC	CD3 パーcpCy5.5	テトルギャグAPC	FVD eフルーオ 780	ヘキスト33342	CD8 BUV805	ペントギャグPE
キ67 FMO		CD3 パーcpCy5.5	テトルギャグAPC	FVD eフルーオ 780	ヘキスト33342	CD8 BUV805	ペントギャグPE
テトルギャグAPC FMO	キ67 FITC	CD3 パーcpCy5.5		FVD eフルーオ 780	ヘキスト33342	CD8 BUV805	ペントギャグPE
ペントギャグPE FMO	キ67 FITC	CD3 パーcpCy5.5	テトルギャグAPC	FVD eフルーオ 780	ヘキスト33342	CD8 BUV805
CD8 FMOの	キ67 FITC	CD3 パーcpCy5.5	テトルギャグAPC	FVD eフルーオ 780	ヘキスト33342		ペントギャグPE
CD3 FMOの	キ67 FITC		テトルギャグAPC	FVD eフルーオ 780	ヘキスト33342	CD8 BUV805	ペントギャグPE
固定可能な生存率染料FMO	キ67 FITC	CD3 パーcpCy5.5	テトルギャグAPC		ヘキスト33342	CD8 BUV805	ペントギャグPE
ヘキスト33342 FMO	キ67 FITC	CD3 パーcpCy5.5	テトルギャグAPC	FVD eフルーオ 780		CD8 BUV805	ペントギャグPE

>表2:フローサイトメーターの設定。

の の の

楽器	BD LSRフォルテッサ
レーザー	ブルー 488nm		赤639nm		UV 355nm		黄/緑561nm
バンドパスフィルター	530/30	710/50	14分の670	780/60	530/30	820/60	585/15	780/60
ロングパスフィルター	505LPレコード	685LPレコード		750ポンド	505LPレコード	770リプレス		750ポンド
蛍光色素/使用染料	フィッツ	PERCPCY5.5	APCの	eフルーア780	ヘキスト33342	BUV805	PE	PECY7
fcs ファイル内の対応する名前	アレクサフロー488	PERCPCY5.5	APCの	APC-H7	ヘキストレッド	BUV737	PE	PECY7

結果

図1:BM細胞の細胞周期解析。未処理のBalb/cマウスのBM細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析しました。(A) ゲーティング戦略の例。DNA-A/-Wプロット(左)の単一細胞にゲートし、続いて死細胞色素排除法(中央)によって生細胞にゲートしました。次に、すべてのBMセルに「緩和された」FSC-A/SSC-Aゲートを使用しました(右)。(B)BM細胞の細胞周期解析の例(左)。細胞周期の次の段階の細胞を同定するために、Ki67とDNA染色の組み合わせを使用しました:G₀(左下象限、Ki67neg-DNAlow細胞)、G₁(左上象限、Ki67pos-DNAlow)、S-G₂/M(右上象限、Ki67pos-DNA中間体/高)。Ki67 mAbの蛍光マイナス1(FMO)制御(中央)とDNAヒストグラム(右)を示しています。DNAヒス...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-200 μL ユニバーサルフィットバルクパックピペットチップ	コーニング	CLS4866-1000EA
2.4G2 抗 FcγR mAb	BDの	553141	10 μg/mL 最終濃度
5mlシリンジプランジャー	BDエメラルド	307733
15mlコニカルチューブ	MercKミリポア	SBHA025SB
60 mm TC処理細胞培養ディッシュ	隼	353002
70 μmセルストレーナー	隼	352097
96ウェルクリアラウンドボトムTC処理培養マイクロプレート	隼	353077
アンチラット/ハムスターIg、k/ネガティブコントロール補償粒子	BD-バイオサイエンス	552845
β-メルカプトエタノール	シグマ	M3148
ウシ血清アルブミン	シグマ	A07030 (英語)
BUV805ラット抗マウスCD8a	BD-バイオサイエンス	564920	4 μg/mL 最終濃度
ダルベッコのリン酸塩緩衝液生理食塩水 カルシウム マグネシウムなし	ユーロクローン	ECB4004L
Eppendorf Safe-Lock チューブ、1.5 mL	エッペンドルフ	30120159
エタノール	シグマ	34852-1L-M
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩溶液(EDTA)	シグマ	E7889
ウシ胎児血清	コーニング	35-079-CV
Filcon、滅菌済み、シリンジ型 70 μm	隼	352350
固定性生存率染料 eFluor 780	eバイオサイエンス	〒65-0865-14	1:1000最終濃度
Foxp3 / 転写因子染色バッファーセット	eバイオサイエンス	00-5523-00	固定・透過濃縮液と希釈液、透過化バッファー10倍が入ったセットです
H-2k(d) AMQMLKETIアロフィコシアニン(APC)標識四量体	NIH Tetramer Core Facility提供		6 μg/mL 最終濃度
H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) 標識五量体	プロイミューン	F176-2A-E-176	10 μL /サンプル
Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物 - 10 mg/mL 水溶液	サーモフィッシャー	H3570-J
Ki-67 モノクローナル抗体 (SolA15), FITC	eバイオサイエンス	11-5698-82	5 μg/mL 最終濃度
L-グルタミン 100X (200 mM)	ユーロクローン	ECB3000D
Millex-HAフィルター 0.45 μm	BDの	340606
ペニシリン/ストレプトマイシン100X	ユーロクローン	ECB3001D
PE/Cyanine7 抗マウス CD62L 抗体	バイオレジェンド	104418	0.2 μg/mL 最終濃度
PerCP-Cy™5.5 ハムスター 抗マウス CD3e	BD-バイオサイエンス	551163	4.4μg/mLの最終濃度
赤血球溶解バッファー	シグマ	R7757
丸底ポリスチレンチューブ、5 mL	隼	352058
RPMI 1640 ミディアム L-グルタミンなし フェノールレッド	ユーロクローン	ECB9006L
フローサイトメトリーデータを解析するためのソフトウェアパッケージ	フロージョ	10節
フローサイトメーターでサンプルを取得するためのソフトウェア	BD FACSDiva (英語)	6.2
トリパンブルーソリューション	ユーロクローン	ECM0990D

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