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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 注射用材料の準備
- 33Gの針とシリンジを滅菌する:115 οCで分解してオートクレーブし、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で上昇させて注射用の針を準備します。
- 蛍光標識粒子を室温で5〜10分間解凍し、カルシウムイオンとマグネシウムイオン(Ca 2+/Mg 2+)を含む滅菌PBS中の50 mg/ml溶液に再溶解して、注射用の粒子溶液を調製します。(Ca2+/Mg2+)
手記：このプロトコルでは、食作用アッセイで検証された真菌起源のAF488標識粒子が使用されます。最適な取り込みを得るには、注入直前に新鮮な粒子を調製します。
ノート2:粒子濃度は、特定の実験ごとに最適化できます。
2. ビーズ溶液の硝子体内注入
>注:注射を行う人はマウスを保持して眼球に焦点を合わせ続けることができ、もう一人は装填された注射器を通過させてプランジャーを押すことができるように、注射を行うには2人が必要です。
- げっ歯類に麻酔をかけ、体重 10 g あたり 10 g の用量で 100 mg/ml ケタミンと 10 mg/ml キシラジンを腹腔内注射します。注射する前に、つま先をつまんで麻酔のレベルを評価します。
手記：イソフルランは骨髄細胞機能に大きな影響を与えるため、このアッセイ全体での使用は避けるべきです。
- 蛍光標識粒子溶液0.5 μlを針にロードします。
- マウスを横向きにして手術用顕微鏡の下に置きます(図1A-B)。マウスの位置決めを良くするために、ゲルパックなどの柔らかい素材を使用してください。目がまだ開いていない若いマウスの場合は、スリットに沿って亀裂を作り、そこからまぶたが最終的に開くことにより、細かい45°の角度のついた鉗子を使用してまぶたを静かに開きます。
- 細かい45°の角度のついた鉗子の助けを借りて、眼球がソケットからわずかに飛び出すように、まぶたの周りに慎重に圧力をかけます。耳のすぐ上と顎のそばに2本の指で頭を持ち、まぶたと平行に皮膚をそっと伸ばして、目がソケットからわずかに外れないようにします。喉に近づきすぎないように注意してください(図1B)。
- 眼球に穴を開けるには、注射器の針を角膜辺帯(角膜と強膜がつながる場所)に挿入します。これは、色素沈着したマウスでは灰色の円として見えます。針を少し引っ込めて少量の硝子体液を排出し、注入します。注射を行う人は、片手でマウスを、もう一方の手で針を優しく持つ必要があります。2人目はゆっくりとプランジャーを押す必要があります。
- シリンジをゆっくりと引っ込めます。目の保湿点滴を塗って、目の潤いを保ちます。
- げっ歯類をヒートパッドの上のケージで回復させ、動物を監視し続けます。子犬と一緒に作業する場合は、動物が呼吸して自発的に動くことができるようになるまで、動物を他の警戒動物と一緒にケージに戻さないでください。大人と一緒に働く場合は、げっ歯類が胸骨の横臥を回復するまで、げっ歯類を他の警戒動物と一緒にケージに戻さないでください。
3. 網膜組織の採取
>注:蛍光標識粒子が注入されていない眼からの網膜組織は、フローサイトメトリー分析のコントロールとして収集する必要があります。アッセイは単一の網膜を使用して実行できますが、最高のパフォーマンスを得るには、2つの網膜を一緒にプールする必要があります。
- 蛍光標識粒子の硝子体内注射の3時間後に網膜組織を採取します。
手記：粒子溶液の注入後の時間は、特定の実験ごとに最適化できますが、注入後3時間後には、網膜のほとんどの層で粒子の取り込みが見られることがわかりました(図1C-D)。
- 子宮頸部脱臼によるマウスの犠牲。
- 眼球を支え出すために、細かい45°の角度のついた鉗子の助けを借りてまぶたを優しく押して眼球を集めます。鉗子を眼球の後ろに置き、引っ張ります。
- 解剖顕微鏡で網膜を解剖します。眼球を、Ca2+/Mg2+のPBSを少量含むシャーレに移します。ペトリ皿の乾燥した領域で、極細鉗子の先端で角膜輪の眼球に穴を開けます。
- 細かい45°の角度のついた鉗子の助けを借りて眼球を保持し、スプリングハサミを使用して角膜辺縁部の周囲を切断し、角膜辺縁部の円周の約半分が切断されるまで切断します。
- 細かい45°の角度のついた鉗子で眼球を保持し、眼球をPBSに持ってきます。2組目の細かい45°の角度のついた鉗子で角膜と強膜を引き裂きます。レンズと網膜は無傷で出てきます。
- レンズと網膜を分離します。網膜を採取し、Ca2+/Mg2+のPBSを2ml含んだ5.4mlのポリスチレン試験管に移します。
>4. 単一細胞懸濁液の準備
- ニューロン組織解離キットを使用して、製造元の指示に若干の変更を加えたシングルセル懸濁液を調製します。簡単に言うと、P1000ピペットでピペッティングを上下させ、37°Cで振らずに酵素消化を行うことで、網膜を粉砕します。
5. フローサイトメトリー解析のための単一細胞懸濁液の染色
- 細胞を200 μlの染色バッファー(0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.09%アジ化ナトリウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)に再懸濁し、U底96ウェルプレートに移します。130 x g.
で5分間遠心分離します。
手記：アジ化ナトリウムは、人間と環境に有害です。適切な個人用保護具を使用し、地域の規制に従って廃棄物を廃棄してください。
- シンクの上でプレートを反転させて、上澄みを捨てます。Fc受容体をブロックするには、ウェルあたり5 μg/mlの抗マウスCD16/CD32抗体を含む25 μlの染色緩衝液に細胞を再懸濁します。室温で5分間インキュベートします。
- 0.5 μg/mlの抗マウスLy6C-APC-Cy7、0.5 μg/mlの抗マウスLy6G-Pe-Cy7、および2.5 μg/mlの抗マウスCD11b-BV650を含む染色バッファー25 μlを添加し、室温で15分間暗所でインキュベー
トします。
- 130 x gで5分間遠心分離し、プレートを反転させて上清を捨てます。細胞を200 μlの染色バッファーに再懸濁して洗浄します。
- 130 x gで5分間遠心分離し、0.5 μg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)を含む200 μlの染色バッファーに再懸濁します。1.2mlのマイクロタイターチューブに移します。
- 0.5 μg/mlのPIを含む100 μlの染色バッファーでウェルを洗浄し、1.2 mLのマイクロタイターチューブで前の200 μlとプールします。染色した細胞の総容量は300μlです。
6. フローサイトメトリー解析
- 従来の3つのレーザー(バイオレット、ブルー、レッドレーザー)を使用して、非常に明るい蛍光AF488粒子からの大きな波及効果のため、PE、PerCP-Cy5.5、BV510、およびPI染料を避けてください。このアッセイを最適化するには、PE標識抗体とPI(PerCP-Cy5.5チャネルではなくmCherryチャネル)を使用できるため、4番目のレーザー(黄色)を使用します(図2)。
手記：黄色のレーザーが利用できない場合は、別のチャネルで死細胞排除色素を使用してください。
- PIネガティブセル(PI-)をゲートして、デッドセルを除外します(図2B)。
- 死細胞を除外した後、CD11b陽性細胞(CD11b +)をゲートすると、これにはすべての骨髄細胞が含まれます(図2C)。
- CD11b+集団内で、Ly6C-/Ly6G-をゲートして好中球(CD11b+/Ly6G+)と単球(CD11b+/Ly6C+;図 2D)。ミクログリア(ここでは簡単にするためにCD11b + / Ly6C - / Ly6G-と定義)でゲーティングした後、2つの明確な集団が見えるはずです。1つはネガティブ、もう1つは蛍光標識された粒子に対してポジティブです。食細胞は粒子を取り込み、したがってAF488+(図2E)になります。
手記：Ly6C陽性またはLy6G陽性の集団も分析し、この染色アプローチを使用して粒子の取り込みを測定することができます。食作用性CD11b+細胞の割合は、食作用性ミクログリアの割合とよく相関しています(図2F)。フローサイトメトリーの経験がない研究者の場合、CD11b染色のみによる簡単な分析を行うことができますが、これには食作用性好中球と単球、およびミクログリアが含まれます。このCD11b+/Ly6C-/Ly6G-集団内では、これらの細胞はマーカーF4/80およびCX3CR1で染色することにより判断されるように、99%のミクログリア>。これらのマーカーは追加できますが、私たちの手には必要ありません。
