方法論記事

末梢血単核細胞中の免疫細胞サブセットを同定するためのフローサイトメトリーアッセイ

2025年7月8日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:Torchia, M. L. G., et al. Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、2つの蛍光色素を使用して、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)のCD4+およびCD8+ T細胞、γδT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、および単球を同定するフローサイトメトリーベースの手法を示しています。表面マーカーに対する蛍光色素標識抗体と細胞をインキュベートすると、最適なフローサイトメトリーゲーティング戦略を使用して細胞サブセットが同定されます。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>注:このプロトコルは、新鮮または凍結された分離された末梢血細胞および全血でテストされています。

1. 細胞染色

>注:スペクトルのオーバーラップがほとんどない蛍光色素のペアを選択することは、他の蛍光色素検出器での蛍光色素の高波及によるデータの拡散を減らすために重要です。すべての細胞サブセットを最適に同定するには、抗体ペアPE-BV421やPE-APCなど、量子収率の高い蛍光色素を使用する必要があります。

  1. 生鮮および冷凍PBMCの染色
    1. 100 μL の PBMC (1 x 106 セル) を 96 ウェル V 底プレートに移します><。 手記： 1 x 106 未満の任意の数のセルを使用しても、同様の結果が得られます。
    2. 350 x gでRTで3分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。各ウェルに、タンパク質上の遊離アミンと10分間反応して死細胞を標識する生/死固定色素を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を100 μL加えます。
    3. すべての抗体(蛍光色素A中の抗CD3.-CD56、TCRγδ、蛍光色素B中の抗CD4、CD8、CD19、CD14)を含む混合物を各サンプル30μL調製します。抗体の濃度を表1および表2に示します。この段階では、異なる標的分子および異なる蛍光色素に対する滴定抗体も添加できます(例:表3).
      手記： 抗体の濃度は、メーカーやロット番号によって異なります。したがって、最適な信号を得るために予備テストを行う必要があります。PBS、PBS/0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、PBS/0.2%アジ化ナトリウム、またはPBS/0.5%BSA/0.1%アジ化ナトリウムを使用し、抗体を希釈するために同様の結果を得た。また、細胞を30 μLとは異なる容量で染色することもでき、この方法論を既存の染色プロトコルに容易に統合できます。
    4. 350 x gでRTで3分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。抗体カクテルを各ウェルに加え、気泡が発生しないように慎重に再懸濁します。暗闇の中でRTで30分間インキュベートします.
      手記： サンプルを4°Cで染色すると、同様の結果が得られます。
    5. 150 μLの染色バッファーを添加し、350 x gで室温で3分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。細胞を200 μLのPBSに再懸濁し、フローサイトメーターでデータを取得します。染色量を変更する場合は、余分な抗体の洗浄に使用した元の抗体ミックスの少なくとも20倍に希釈してください.
      手記： 染色した細胞は、PBS/2%パラホルムアルデヒド内に固定し、4°Cの冷蔵庫で一晩保存した後、翌日フローサイトメーターで取得することができます
      注意： パラホルムアルデヒドは、飲み込むと有害であり、皮膚の炎症を引き起こす可能性があります

2. 抗体滴定

>注:抗体滴定は、高品質で再現性のあるデータを取得するための最も重要なステップです。抗CD3、-CD8、-CD14、-CD19、および-TCR γδの滴定は、陽性ピークと陰性ピークを最適に分離する抗体の濃度を最大染色指数によって導き出す標準的な手順に従います。染色指数曲線の立ち上がり側のピークまたはピークに近い希釈液を選択する必要があります(図 1A-C)。抗CD4抗体は、CD4陽性集団のピークをCD3単一陽性集団とCD3+/CD8+ T細胞との間に配置し、CD3単一陽性シグナルに近づけるように滴定して、CD8dim集団(CD8+ γδ T細胞およびNK T細胞)をよりよく識別します。同様に、CD56滴定は、NK CD56+細胞をCD3+とCD3-集団の間に位置付けることを目的としています。

  1. 最大染色指数曲線
    注:    抗CD3、-CD8、-CD14、-CD19、および-TCR γδの滴定は、陽性ピークと陰性ピークを最適に分離する抗体の濃度を最大染色指数曲線によって導き出す標準的な手順に従います。他のマーカーに対する抗体をパネルに添加する場合は、それらも最大染色指数曲線で滴定する必要があります。
    1. 96ウェルプレートの10ウェルに40 μLの染色バッファーを充填して、2倍抗体希釈液を調製します。最初のウェルで、最終容量を80 μLの染色バッファーに増やし、目的の抗体をメーカーが推奨する濃度の4倍の濃度で添加します。
    2. よく混合し、40 μLを2番目のウェルに移します。よく混ぜて、他のすべてのウェルに対してこの手順を繰り返します。
    3. PBMCまたは全血の10サンプルを、前述のプロトコルに従って、10種類の2倍希釈抗体のうち30μLで染色します。
    4. フローサイトメーターでデータを取得し、各希釈液からのシグナルをプロットします(図1A)。
    5. 各抗体濃度の陰性集団と陽性集団をゲートします。抗体の濃度を上げると、バックグラウンドが高くなる可能性があります。したがって、それに応じてネガティブゲートのサイズを変更します。
    6. 各抗体濃度について、ネガティブ集団の蛍光強度の中央値と標準偏差、および陽性集団の蛍光強度の中央値に関する情報を抽出します。各抗体濃度について、(陽性集団の蛍光強度中央値 - 陰性集団の蛍光強度中央値)÷(陰性集団の蛍光強度の標準偏差の2倍)(図1B)で染色指数を計算します。
    7. 抗体希釈分の割合で表される抗体濃度に対する染色指数と抗体濃度をプロットし(例:1:10希釈 = 0.1)、最大染色指数値で抗体の濃度を特定します(図1C)。
  2. 抗CD4および-CD56抗体滴定
    注:    抗CD4および-CD56抗体の滴定は、2-蛍光色素パネルの他のマーカーの以前の滴定に依存します。抗CD4抗体の場合、滴定は、ダブルCD8+/CD3+シグナルとCD3シングルポジティブポピュレーションの間に抗CD4シグナルを配置することを目的としています(図1D)。
    1. 前述したように、抗CD4抗体とCD56抗体を2倍希釈法で滴定し、その間に追加の濃度を追加して、CD4+ T細胞とNK細胞を他の細胞集団から分離できる濃度範囲を細かく特定します。
    2. ダブルCD8+/CD3+シグナルとCD3シングルポジティブ集団の間に抗CD4シグナルを配置して、抗CD4抗体を滴定します(図1D)
      手記：CD4+ T細胞をCD8+ Dim集団から明確に分離するためには、特別な注意を払う必要があります。
    3. 抗CD4抗体の滴定と同様の戦略に従って、CD3陰性集団とCD3陽性集団の間にNK細胞を配置することにより、抗CD56抗体を滴定します。

>3. ゲーティング戦略

  1. リンパ球細胞集団と単球細胞集団を同定し、死んだ細胞と残存する赤血球の大部分を分析から除去します。
    1. リンパ球と単球を含む全集団を、前方散乱角と側方散乱光角(FSC-A対SSC-A)に基づいて選択します。前方散乱高さと前方散乱幅(FSC-H対FSC-W)および側面散乱高さと側面散乱幅(SSC-H対SSC-W)を使用して、セル凝集体を解析から除去します。
    2. 生死識別マーカーを使用して、明るい陽性の死細胞と残存赤血球を分析から除外します。異なるFSC-AおよびSSC-Aプロファイルに基づくリンパ球および単球のゲート。
  2. リンパ球集団の2-蛍光色素7マーカーゲーティング戦略.
    手記：CD3陽性サブグループ内では、CD4、CD8+、およびγδT細胞は、CD4、CD8、およびγδ受容体のみを標的とする抗体を使用して分離できます。同様に、CD3陰性サブグループ内では、CD19、CD56、およびCD14に対する抗体を用いて、B細胞、NK細胞、および単球をそれぞれ一意に同定することができる。
    1. リンパ球ゲートを選択し、このプロトコルで使用される2つの蛍光色素のうちの1つを各軸に持つドットプロットを作成します(図2B)。
    2. ドットプロットの右上隅にあるCD3+/CD8+ダブルポジティブ細胞として同定されたCD8+ T細胞のゲート。NKT細胞を含む可能性のある薄暗いCD8集団を除外します。CD8+ T細胞とCD3単一陽性集団の間の集団として同定されたCD4+ T細胞のゲート。γδ T細胞のゲートオンは、高CD3細胞として同定されました。γδT細胞をCD8陽性細胞とCD8陰性細胞で再分割します。
    3. CD3陽性細胞とCD3陰性細胞の間の集団として同定されたNK細胞上のゲート。NK細胞をCD8陽性とCD8陰性で再分割します。ドットプロットの右下隅にあるCD3陰性CD19+集団として同定されたB細胞のゲート。
    4. 単球ゲートを選択し、このプロトコルで使用される2つの蛍光色素のうちの1つを各軸に示したドットプロットを作成します(図2C)。CD3-/CD14+集団のゲート。

>表1:PBMCの2フルオロクロム免疫細胞染色(BV421-PE併用)に使用した抗体パネル。

の の の の壁紙 の の の の の の の の )
ターゲットクローン蛍光色素売り手濃度目的
CD3UCHT1BV421BDの1月20日血筋
CD56NCAM16.2BV421BDの1/900
TCRγδB1BV421バイオ1月30日
CD4RPA-T4PEBDの1/450
CD8RPA-T8PEBDの1月20日
CD14M5E2PEBDの1月15日
CD19HIB19PEBDの1/300
死んだ細胞L/DブルーLT(リトリー1/300生死差別
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

>表2:PBMCの2フルオロクロム免疫細胞染色(APC-PE併用)に使用した抗体パネル。

の の の 日 の壁紙 の の の の の の の の )
ターゲットクローン蛍光色素売り手濃度目的
CD3UCHT1APCのBDの1月20日血筋
CD56NCAM16.2APCのBDの1月60
TCRγδB1APCのバイオ1月30日
CD4RPA-T4PEBDの1/450
CD8RPA-T8PEBDの1月20日
CD14M5E2PEBDの1月15日
CD19HIB19PEBDの1/300
死んだ細胞L/DブルーLT(リトリー1/300生死差別
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

表3:多発性骨髄腫患者の凍結PBMCを染色するために使用した抗体パネル。

の の の の壁紙 の の の の の の の の の の 日 の 日 の の の )
ターゲットクローン蛍光色素カタログ売り手濃度目的
CD3UCHT1BV421562426BDの1月20日血筋
CD56NCAM16.2BV421562751BDの1/900
TCRγδB1BV421331217バイオ1月30日
CD4RPA-T4PE555347BDの1/450
CD8RPA-T8PE555367BDの1月20日
CD14M5E2PE555398BDの1月15日
CD19HIB19PE555413BDの1/300
CCR7G043H7AF647353217バイオ1月30日区別
CD45RAハイ100APC-H7560674BDの1月60
CCR41G1PE-Cy7561034BDの1月60thサブセット
CCR6G034-E3BV605353419バイオ1月30日
CXCR31C6/CXCR3AF488561730BDの1月30日
CD57NK-1PE-CF594562488BDの1/900アクティベーション/枯渇
HLA-DRG46-6BV510563083BDの1月30日
CD163G8BUV395563784BDの1月30日NK、単球活性化
デッドセルL/DブルーL-23105LT(リトリー1/300生死差別

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
図1:代表的な抗体滴定。(A)ドットプロットは、指示された濃度の抗体で染色された新鮮なPBMCでのCD8発現を示しています。(B)この表は、CD8+の蛍光強度の中央値と標準偏差、CD8-の母集団の蛍光強度の中央値、および試験した各濃度の導出された染色指数を表しています。(C)グラフは、抗体の最適濃度を染色指数の関数として導出する方法を示しています。(D)CD4抗体の代表的な滴定。パネルDはBoin et al. 2017から修正されました。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CD3BDバイオサイエンス562426染色用抗体
RRIDのAB_11152082
CD56BDバイオサイエンス562751染色用抗体
RRID:AB_2732054
TCRgdのBDバイオサイエンス331217染色用抗体
RRID番号: AB_2562316
CD4BDバイオサイエンス555347染色用抗体
RRIDのAB_395752
CD8BDバイオサイエンス555367染色用抗体
RRIDのAB_395770
CD14BDバイオサイエンス555398染色用抗体
RRID:AB_395799
CD19BDバイオサイエンス555413染色用抗体
RRID:AB_395813
CD3BDバイオサイエンス555335染色用抗体
RRIDの番号: AB_398591
CD56BDバイオサイエンス555518染色用抗体
RRIDの番号: AB_398601
TCRgdのBDバイオサイエンス331211染色用抗体
RRIDの番号: AB_1089215
CCR7バイオレジェンド353217染色用抗体
RRIDの:AB_10913812
CD45RABDバイオサイエンス560674染色用抗体
RRID:AB_1727497
CCR4BDバイオサイエンス561034染色用抗体
RRIDの番号: AB_10563066
CCR6BDバイオサイエンス353419染色用抗体
RRID:AB_11124539
CXCR3BDバイオサイエンス561730染色用抗体
RRID番号: AB_10894207
CD57BDバイオサイエンス562488染色用抗体
RRIDのAB_2737625
HLA-DRBDバイオサイエンス563083染色用抗体
RRID:AB_2737994
CD16BDバイオサイエンス563784染色用抗体
RRIDの番号: AB_2744293
死んだ細胞ライフテクノロジーL-23105生死差別
96ウェルVボトムプレートサーモフィッシャー249570染色用プレート
FACSAria IIu セルソーターBDバイオサイエンスフローサイトメーター
FCSエクスプレス6de novoソフトウェアFACS分析
グラフパッドプリズムGraphPadソフトウェアデータ分析
の の の の の の の

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タグ

2 CD4 T CD8 T

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