免疫細胞の表現型および機能的特性評価のためのバーコードアッセイ

Abstract

出典:Baxter, R. M., et al. シングルセル解析による末梢全血の免疫表現型とサイトカイン産生の質量サイトメトリーによる分析。

このビデオでは、重金属標識抗体を使用して細胞のバーコード化を行うシングルセルプロテオミクス法を紹介しています。その後、免疫染色とマスサイトメトリーを適用して、ヒト全血由来免疫細胞の免疫表現型および機能的変化を評価します。

Protocol

1. 溶解/固定された血液細胞のバーコード

1. -80°Cで保存した溶解/固定細胞サンプルを氷上でゆっくりと解凍し、最大20個のサンプルを独自のバーコードで標識し、このシステムを使用してプールすることができます。10X Barcoding PermバッファーをPBSで1:10希釈します。サンプルあたり~3 mLの十分な緩衝液を作成します。
2. 1つの非滅菌トラフにCSMを充填し、もう1つに1Xバーコードパーマバッファーを充填します。解凍したばかりのサンプルに氷冷したCSM1 mLを加え、ピペットで十分に混合し、事前にラベル付けしたポリプロピレンクラスターチューブに移します。
3. 10 μLのサンプルを採取し、自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞をカウントします。各クラスターチューブ内のサンプルあたりの細胞数を1.5–2 x 10⁶細胞に正規化します:2 x 10⁶細胞を超える余分な細胞の量を取り除き、廃棄します。
4. 細胞を600 x gで室温で5分間遠心分離します。マルチチャンネルピペットで1 mLの1X Barcoding Permバッファーに細胞を再懸濁し、600 x gで室温で5分間遠心分離します。上清を吸引します。
5. バーコードキーに示されているのと同じ順序でクラスターチューブをラックに並べて、サンプルがバーコードと一致するようにします。マルチチャンネルピペットによる800 μL 1X Barcoding Permバッファーを、ピペットチップで細胞ペレットに触れることなく(混合せずに)、クラスターチューブ内のすべてのサンプルに添加し、細胞損失を減らします。クラスターチューブと一緒にラックを脇に置きます。
6. 20-plex Pd Barcoding Kitチューブストリップを-20°Cから取り出し、室温で解凍します。1X Barcoding Perm Buffer 100 μL を添加し、十分に混合し、再懸濁したバーコードミックス 120 μL をクラスターチューブ内の対応する細胞サンプルに移します。
7. マルチチャンネルピペットで十分に混合し、個別にバーコード化されたサンプル間の相互汚染がないようにします。クラスターチューブを室温で30分間インキュベートし、バーコードで細胞を標識します。
8. 600 x gで5分間、室温で遠心分離します。上清を吸引し、1 mLのCSMに再懸濁します。
9. CSMで再び遠心分離して再懸濁します.
   手記：各サンプルには一意のバーコードが貼付され、サンプルをプールする準備が整いました。
10. 600 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を吸引します。1つのピペットで同じチップを使用して、残留容量~70〜80 μLのすべての細胞ペレットを1本のポリスチレンチューブに移します。ピペットチップをイジェクトしないでください。このチップでシングルピペットを脇に置きます。
11. マルチチャンネルピペットと新しいチップを使用して、各元のクラスターチューブに~100 μL CSMを添加し、細胞の回収率を最大化します。チップを脇に置いたシングルピペットで、~100 μLの残量にあるすべての細胞ペレットを同じポリスチレンチューブに移します。
12. CSMをポリスチレンチューブ(~3mL)に補充します。プールされたバーコードセットのセル番号をカウントして記録します。600 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を吸引します。バーコード化されたサンプルを同日に染色してください.
    注:バーコード化プロセスで20~30%の細胞損失が予想されるのが普通です。

2. バーコード化された溶解/固定血球の染色とマスサイトメトリー装置による解析の準備

>注:染色抗体の1X力価(100 μLの染色反応につき1 μLの抗体)は、通常、3–4 x 10⁶細胞を染色できます。したがって、バーコード化されたすべてのサンプルを1つのチューブにプールすると、抗体の量をスケールアップする必要があります。20個のバーコード付きサンプルが30 x 10⁶細胞に相当し、各1X力価が3–4 x 10⁶細胞を染色できる場合、バーコード付きサンプルは10X力価のみを必要としますが、各サンプルを個別に染色すると20倍の量(個々のチューブごとに1X)の抗体が必要になります。細胞数に対する抗体の濃度は、個々の抗体カクテルごとに慎重に滴定する必要があります(ここでは説明しません)。

1. 抗体(Table of Materials)を使用して細胞を染色し、表面染色とサイトカイン誘導を行います。
   1. 添加する量を計算し、ピペッティング誤差を考慮して表面染色カクテルを作成します(つまり、各サンプル中の2 x 10⁶細胞のバーコード付きサンプル20個を染色する場合、10倍の力価染色が必要です。最終容量の計算には、10.5倍の最終染色溶液を作成することでピペッティング誤差を補正します)。
   2. バーコード化された細胞ペレットに10倍相当の表面染色量を加えます。細胞損失を減らすには、同じチップで、表面染色物と細胞ペレットの量を混合して測定します。
   3. 細胞の量と染色カクテルに基づいて、CSMを細胞サンプル数あたり50 μLの最終染色量に添加します(つまり、20サンプルのセットを実行する場合は、50 μL X 20 = 1 mL)。4°Cで30分間インキュベートし、サンプルを15分ごとに撹拌して均一な染色を促進します。
   4. 表面染色インキュベーション中に、ろ過されたddH₂Oで1:10に希釈してPerm/Washバッファー(材料表)を調製します。透過化用に2 mL、洗浄用に5 mLの容量を準備します。4°Cまたは氷の上に置いてください。
   5. 表面染色チューブにCSMを充填し、600 x g、4°Cで5分間遠心分離します。バーコード付きサンプルを 2 mL の 4 °C、1:10 希釈 Perm/Wash バッファーに再懸濁します。4°Cで20〜30分間インキュベートし、細胞を完全に透過化します。
   6. 600 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
   7. 細胞内染色については、(表面染色の場合と同様)同様の染色手順に従います。ただし、CSMの代わりに4°C、1:10希釈のPerm/Washバッファーを使用して総染色量を作成し、細胞が細胞内染色全体を通じて透過性環境に留まるようにします。
   8. 染色および透過処理した細胞ペレットの表面に細胞内抗体カクテルを添加します(ステップ2.1.2–2.1.7)。総染色量を細胞サンプル数あたり50 μLにします。4°Cで60分間インキュベートし、サンプルを15分ごとに攪拌して、均一な染色を確保します。
   9. 細胞内染色中に、インターカレーター溶液を調製します:ろ過済みPBS900μL+ろ過済み16%PFA100μL(最終濃度1.6%PFA)+0.2μLの500μMのインターカレーター色素(材料表)。
   10. 細胞ペレット+細胞内抗体カクテルに、冷たい1:10 Perm/Washバッファーを注ぎます。
   11. 600 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。染色チューブにCSMを充填します。セル番号をカウントして記録します。600 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。ステップ4.9のインターカレーター溶液1mLに細胞を再懸濁します。室温で少なくとも20分間インキュベートして完全なインターカレーションを行うか、4°Cで一晩インキュベートします(インターカレーター溶液中のサンプルは、マスサイトメトリー装置で分析する前に最大1週間4°Cに留まることができます)。
2. マスサイトメトリー装置用の細胞を調製します。
   1. ろ過したddH₂Oを3 mLでチューブに充填し、600 x gで4 °Cで5分間遠心分離します。ろ過したddH₂Oの3 mLで細胞を再懸濁します。この懸濁液を100 μmフィルターに通して、マスサイトメトリー装置を詰まらせる可能性のある破片や凝集体を取り除きます。
   2. ろ過後の細胞数をカウントして記録します。600 x g で 5 分間、4 °C で遠心分離
   します。
3. キャリブレーションビーズ溶液(材料表)を、ろ過されたddH₂Oで1:10に希釈して調製します。
4. 染色した細胞を必要量の1:10希釈キャリブレーションビーズ溶液に再懸濁し、細胞濃度を~1 x 10⁶細胞/mLにします
   手記： 45 μL/minのCyTOF1の場合、推奨される最適値は5 x 10⁵細胞/mLです。Heliosの場合、30 μL/min、7.5 x 10⁵細胞/mL。
5. マスサイトメトリー装置でサンプルを泳動します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ルキソリチニブ	サンタクルス	SC-364729Aの	ストックコンク:10 mM;最終濃度:5 μM
R848	インビボゲン	TLRL-R848-5	ストック濃度:1μg/μL;最終濃度:1 μg/mL
LPS-EK	インビボゲン	TLRL-EKLPSの	ストック濃度:1μg/μL;最終濃度:0.1 μg/mL
滅菌PBS	ロンザ	17-516階
Lyse/Fix バッファー	BDバイオサイエンス	558049	ストックコンク:5倍;最終濃度:1X(ddH2Oで希釈)
BD Phosflow パーマ/ウォッシュバッファー I	BDバイオサイエンス	557885	ストックコンク:10X;最終濃度: 1:10 (ddH2Oで希釈)
RPMI(ルプミ)	ギブコ	21870-076
アジ化ナトリウム(NaN3)	シグマ・アルドリッチ	S-8032	株式コンク:>99.9%;最終濃度: 0.0002
タンパク質輸送阻害剤(PTI)	eバイオサイエンス	00-4980-93	ストックコンク:500X;ファイナルコンク:1X
DNAインターカレーター	フルイダイム	201192Bさん	ストックコンク:500μM;最終濃度:0.1 μM
MaxParバーコードパーマバッファ	フルイダイム	201057	ストックコンク:10X;ファイナルコンク:1X
20プレックスPdバーコードセット	フルイダイム	S0014	ストックコンク:なし / a;最終濃度: n/a
マスサイトメトリーに用いる抗体
サーフェスマーカー
CD1cの	バイオレジェンド	L161	間瀬: 161
CD3	BDの	UCHT1	ミサ: 144
CD4	バイオレジェンド	SK3	ミサ: 174
CD7	BDの	M-T701	ミサ: 149
CD8	バイオレジェンド	SK1	ミサ: 142
CD11bの	フルイダイム	ICRF44	ミサ:209
CD11c	BDの	B-ly6(ビーライ6	ミサ: 152
CD15	BDの	ハイ98	総勢:115
CD14	バイオレジェンド	M5E2	ミサ: 154
CD16	eバイオサイエンス/サーモ	B73.1	ミサ: 165
CD19	サンタクルス	SJ25C1	ミサ: 163
CD21	バイオレジェンド	ブ32	質量: 141
CD27	BDの	L128	総勢:155
CD38	フルイダイム	HIT2	ミサ: 172
CD45 合計	バイオレジェンド	ハイ30	ミサ:89
CD45RA	バイオレジェンド	ハイ100	ミサ: 153
CD56	ミルテニー	レア196	ミサ: 168
CD66	BDの	B1.1/CD66	ミサ: 113
CD86	フルイダイム	IT2.2	総勢:150
CD123	フルイダイム	6H6	間瀬: 143
CD278/アイコス	バイオレジェンド	C398.4Aの	ミサ: 156
CD179/PD1	バイオレジェンド	EH12.2H7	総勢: 162
IgDの	バイオレジェンド	IA6-2	ミサ: 146
イグマ	バイオレジェンド	MHM-88	総勢:151
CXCR5	BDの	RF8B2	ミサ: 173
HLADRの	バイオレジェンド	L243	ミサ: 167
サイトカイン
IL-1α	バイオレジェンド	364-3B3-14	ミサ: 147
IL-1β	バイオレジェンド	H1B-98 (英語	ミサ: 169
IL-1RA	サンタクルス	AS17	間瀬: 157
IL-6	バイオレジェンド	MQ2-13A5	ミサ: 164
IL-8	BDの	E8N1	ミサ: 160
IL-12/IL-23p40	バイオレジェンド	C8.6	質量: 171
IL-17Aの	バイオレジェンド	BL168	ミサ: 148
IL23p19	eバイオサイエンス/サーモ	23DCDP	ミサ: 176
MIP1β	BDの	D21-1351	ミサ:158
MCP1	BDの	5D3-F7	ミサ:170
IFNα	ミルテニー	LT27:295	質量: 175
IFNγ	バイオレジェンド	4S.B3	ミサ: 165
PTENの	BDの	A2B1	ミサ: 159
TNFα	バイオレジェンド	マブ11	ミサ: 166
注:メーカーがFluidigmと記載されている場合、この抗体はFluidigm社から金属プレコンジュゲートで購入されたものです。メーカーがFluidigm以外と記載されている場合、この抗体は、メーカーのプロトコルに従ってMaxPar Multi-Metal Labeling Kit(Fluidigm Cat:201300)を使用して自己標識しました。