DNAベースのテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体の力を評価する

要約

出典: Ma, R. et al., DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells. J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオは、ポリエチレングリコールアンカー金ナノ粒子とDNAヘアピンテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体力を評価する方法を示しています。CD8陽性T細胞の相互作用は、プローブのアンフォールディングをトリガーし、蛍光を発しながら、鎖をロックしてシグナルを維持し、免疫細胞が加える力を定量化します。

プロトコル

1. オリゴヌクレオチドの調製

1. リガンド鎖デオキシリボ核酸(DNA)を水に溶解します(18.2MΩの抵抗率、プロトコル全体で使用されます)。卓上遠心分離機で溶液をボルテックスし、スピンダウンします。最終濃度が1 mMになるように水の量を調整します。ナノ滴分光光度計を使用して260 nmの吸光度を測定し、オリゴヌクレオチドの吸光係数に基づいて最終濃度を決定することにより、濃度を検証します。
   手記：リガンド鎖は、各末端(5'アミンおよび3'ビオチン)に修飾があり、フルオロフォアと結合し、ビオチン化リガンドを提示します。リガンド鎖のアミン基は、蛍光色素と結合する必要があります。Cy3B色素は、その高輝度と光安定性のためにこの標識に使用されますが、一般的には商業的に提供されておらず、社内での標識が必要です。したがって、次のセクションでは、アミンとN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル色素との結合について説明します。核酸修飾のための施設やリソースにアクセスできないエンドユーザーのために、修飾核酸は、AlexaやAttoファミリーの色素など、明るく光安定性のある色素を提供するカスタムDNA合成ベンダーから購入できます。
2. 10倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と1 M重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)溶液を調製します。1 mM アミン配位子鎖溶液 10 μL (10 nmol) と 10 μL の 10x PBS、10 μL の 1M NaHCO₃、および 60 μL の H₂O を混合します。使用直前に 50 μg の Cy3B N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS エステル) を 10 μL のジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解し、混合物に添加して総反応量 100 μL にします。Cy3B NHS エステルを添加します前の。室温で1時間または4°Cで一晩反応させます。
3. アミンロッキングストランドをAtto647N NHSエステルと結合させることにより、Atto647Nロッキングストランドを調製します。10x PBS溶液と1 M NaHCO₃溶液を調製します。10 μL の 1 mM アミンロッキング鎖溶液 (10 nmol) を 10 μL の 10x PBS、10 μL の 1M NaHCO₃、および 60 μL の H₂O と混合します。使用直前に 50 μg の Atto647N NHS エステルを 10 μL の DMSO に溶解し、混合物に添加して総反応量 100 μL にします。最後に Atto647N NHS エステルを添加します。室温で1時間または4°Cで一晩反応させます。
4. 反応後、P2脱塩ゲルろ過により副生成物、余分な色素、および塩分を除去します。反応混合物をH₂Oで希釈し、その後の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)精製ステップに適した全容量300 μLにします。650 μLの水和P2ゲルを遠心分離装置に加え、18,000 x gで1分間スピンダウンします。装置の底部にある液体を取り出し、P2ゲルを含むカラムに反応混合物を加え、18,000 x gで1分間スピンダウンし、装置の底部で反応混合物を回収します
   手記：P2ゲルは、H₂Oで使用する前に少なくとも4時間水和する必要があります。
5. オリゴヌクレオチド精製用に指定された C18 カラムを使用し、溶媒 A: 0.1 M 酢酸トリエチルアンモニウム (TEAA) の H₂O および B: アセトニトリル (ACN) を移動相として、0.5 mL/分の流速で 10-100% B の線形グラジエント溶出を行う HPLC で脱塩反応混合物を精製します。デオキシリボ核酸、DNA(260 nm)の吸光度ピーク、および蛍光色素の吸光度ピーク(Cy3Bは560 nm、Atto647Nは647 nm)を持つ製品を回収し、真空遠心濃縮器で一晩乾燥させます(図1Aを参照)。
6. 乾燥させたオリゴ色素製品を100 μLの水で再構成します。Cy3B配位子鎖とAtto647Nロッキング鎖の濃度をナノドロップ分光光度計で測定します。染料のラベリング比率が1:1に近いことを確認してください。必要に応じて、オリゴヌクレオチド濃度を決定する際に色素の260 nmの吸光度を補正します。
7. 50% ACN/H₂O、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)、クエン酸アンモニウム5 mg/mL、0.5 μL、1-5 μMのクエン酸アンモニウムを基質として、3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3-HPA)を基質として使用したマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF-MS)により、精製した製品を検証します。マススペクトルの例を図1Bに示します。
8. ヘアピンストランドとクエンチャーアンカーストランドを水に溶かし、ストック溶液の濃度が50〜100μMであることを確認します
   手記：ヘアピンストランドは変更されておらず、ベンダーから直接カスタム合成できます。アンカーストランドには、チオールアンカーグループとクエンチャーBHQ2があり、ベンダーから直接カスタム合成できます。
9. すべてのオリゴヌクレオチドを分注します。短期間の使用および保管の場合は、これらのオリゴヌクレオチドを4°Cで保存してください。長期保存する場合は、凍結して-20°Cに保管してください。この時点で、すべてのオリゴヌクレオチドはDNAテンションプローブアセンブリの準備ができています.
   手記：凍結融解サイクルを繰り返すことは、オリゴヌクレオチドにとって問題ではありません。

2. 表面処理

>注:DNAヘアピンテンションプローブ基質の準備には2日かかります。DNAヘアピンテンションプローブは、ガラスカバースリップに機能化されます。

1. 1日目
   1. 25 mmのカバースリップを50 mLビーカーのポリテトラフルオロエチレンラックに置きます。各ラックには、最大 8 枚のカバースリップを収納できます。カバーガラスを水に3回沈めてすすぎます。
   2. ラックとカバースリップを含むビーカーに、水と混合したエタノールの1:1比(v:v)の溶液40mLを加え、パラフィンフィルムを使用してビーカーを密封します。
   3. ビーカーを超音波洗浄機(動作周波数35 KHz)で15分間超音波処理し、カバースリップを清掃します。超音波処理後、液体を捨て、ビーカーをラックとその中のカバースリップで少なくとも6回水ですすいで、残っている有機溶媒を取り除きます。
   4. 硫酸と過酸化水素を3:1の比率で混合することにより、新鮮なピラニア溶液を準備します。40 mLのピラニア溶液を作るには、最初にきれいな50 mLビーカーに30 mLの硫酸を加え、次に10 mLの過酸化水素(H₂O₂)をゆっくりと加えます。ピラニア溶液は、H₂O₂を添加すると急速に加熱され、泡立ちます。ガラスピペットの端を使用してピラニアを静かに混ぜます。
   5. 次に、カバースリップを保持しているラックを、エッチング用に軽く混合されたピラニア溶液が入ったビーカーに移します(図2A)。ピラニア溶液をヒドロキシル化し、カバースリップを室温で30分間洗浄します。ピラニアエッチング後、スチールまたはポリテトラフルオロエチレンピンセットを使用してラックを水できれいな50mLビーカーに移し、水で少なくとも6回再度すすいでください><。 注意：大量の有機物質がピラニア溶液と激しく反応し、爆発を引き起こす可能性があります。注意して、常にピラニア溶液をドラフトで使用してください。白衣、手袋、安全ゴーグルを必ず着用してください。新鮮なピラニア溶液を密閉容器に保管しないでください.
      手記：過酸化水素と硫酸の比率は1:2(v:v)未満に保つ必要があり、1:1を超えてはなりません。カバースリップでラックをピラニア溶液に浸すときは、ゆっくりと慎重に溶液に入れてください。エッチング直後の溶液は、まだ活性があり高温であるため、廃棄しないでください。ビーカーに一晩置いてから、酸性廃棄物容器に注ぎます。
   6. カバースリップを保持しているラックを50mLのビーカーに40mLのエタノールを入れて水を取り除きます。エタノールを捨て、3回繰り返して、水が取り除かれたことを確認します。
   7. 次に、ラックを40 mLのエタノール中の3%アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)(v / v)に浸して、カバーガラス上の-OHと室温で1時間反応させます(図2B).
      手記：エタノールはアセトンに置き換えることができます。
   8. 表面を40mLのエタノールに浸して6回すすぎ、80°Cのオーブンで20分間乾燥させます。冷却後、乾燥したアミン修飾カバースリップを-20°Cで保存し、将来の使用に備えます(最大6か月)。
   9. 直径10cmのプラスチックシャーレの底内側をパラフィンフィルムで覆います。パラフィンフィルムは、カバーガラスがペトリ皿内に滑り込むのを防ぎ、カバーガラス上の官能基化の次のステップのための溶液を保持するのに役立ちます。冷却したアミン修飾カバースリップをペトリ皿に入れます。機能化する側が上を向いている必要があります。
   10. カバーガラス上のアミン基を修飾するには、0.5% w/v リポ酸ポリ(エチレングリコール)(PEG)NHS (LA-PEG-SC) と 2.5% w/v mPEG NHS (mPEG-SC) の 0.1 M NaHCO₃ を各カバーガラスに 300 μL 加え、室温で 1 時間インキュベートします (図 2C)。25 mmのカバーガラス1枚につき、1.5 mgのLA-PEG-SCと7.5 mgのmPEG-SCを重量化します。NHS試薬は、室温の水溶液中で半減期が短い(~10分)ため、表面に添加する直前に溶解してください。反応後、表面を水で3回すすいでください。
       手記：NHS反応は、4°Cで一晩行うことができます。NHS試薬は、加水分解前の半減期が4°C(約4〜6時間)で長くなります。これにより、3日間の表面準備手順が必要になります。
   11. 1 mg/mLのスルホ-NHSアセテートを含む0.1 M重炭酸ナトリウムNaHCO₃ 100 μLを「サンドイッチ」カバースリップのセット(2つのカバースリップを互いに向き合い、間に反応バッファーを挟む)に加えます。パッシベーションが少なくとも30分間発生するのを待ちます。試薬を保存するために、このステップは50 μLの1 mg/mL sulfo-NHSアセテートで行うことができます。不動態化後、水で3回すすいでください。
   12. 0.5 mLの金ナノ粒子(AuNP、8.8 nm、タンニン酸、0.05 mg/mL)を各カバースリップに加え、室温で30分間インキュベートします(図2D)。試薬を保存するために、このステップは2つのカバースリップを挟むことによっても行うことができます。金ナノ粒子の凝集を避けるために、前のステップでシステムに塩が存在しないことを確認してください。この手順の後、カバースリップを乾かしたままにしないでください。
   13. 一方、DNAテンションプローブを形成する4.7 pNヘアピン、Cy3Bリガンド鎖、およびBHQ2アンカー鎖を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブ内で300 nMの1 M塩化ナトリウム(NaCl)に1.1:1の比率で構築します。溶液を95°Cまで5分間加熱してストランドをアニールし、その後、サーマルサイクラーで30分間かけて20°Cまで温度を下げて徐々に冷却します。
   14. 金ナノ粒子とのインキュベートの30分後、カバーガラスを水で3回すすいでください。アニーリングしたDNA溶液にBHQ2アンカー鎖(100 μMストック)を追加で加えると、BHQ2アンカー鎖とCy3Bリガンド鎖の比率が10:1になります。この時点で、DNA溶液には300 nMのテンションプローブコンストラクトと2.7 μMのBHQ2鎖が含まれている必要があります。カバースリップ2枚につき100μLを加えて、「サンドイッチ」を作ります(図2E)。
   15. 湿ったラボティッシュボールをペトリ皿(カバースリップから離して)慎重に置き、溶液が乾燥するのを防ぐために皿をパラフィンフィルムで密封します。皿をホイルで覆い、4°Cで一晩インキュベートします。
2. 2日目
   1. カバースリップから余分なプローブを1x PBSで洗い流します。エピ蛍光顕微鏡でDNAテンションプローブの表面品質を確認します。
   2. ストレプトアビジン40 μg/mLを1x PBSに調製し、カバースリップ上で室温で30分間インキュベートします(図2F)。通常、25mmのカバーガラスには100μLで十分です。インキュベーション後、PBSで3回すすぎ、余分な量のストレプタビジンを洗い流します。
   3. 40 μg/mLのビオチン化抗体/リガンドを1x PBSで調製します。サンドイッチあたり50〜100 μLを加え、室温で30分間インキュベートします(図2G)。インキュベーション後、PBSで3回すすぎ、過剰な量のビオチン化抗体/リガンドを洗い流します。
   4. 清潔なイメージングチャンバーを表面で慎重に組み立てます。チャンバーを締めると、表面にひびが入りやすくなります。0.5〜1 mLのハンク平衡塩溶液(HBSS)をイメージングチャンバーに加え、細胞によるイメージングの準備を整えます(図2H)。

>3. 細胞受容体の力のイメージング

1. HBSSで目的の免疫細胞を1-2 x 10⁶細胞/mLで調製します
   手記：この論文では、OT-1 CD8+ナイーブ細胞を例に挙げています。MACSマウスCD8⁺ T細胞単離キットと磁気活性化セルソーティング(MACS)セパレータを使用して、作製マウスの脾臓からOT-1 CD8⁺ナイーブT細胞を精製します。磁気枯渇抗体カクテルが結合している非CD8+ T細胞を除去して、CD8⁺ T細胞を単離し、濃縮します。精製したOT-1 CD8+ナイーブT細胞をHBSSに2 x 10⁶細胞/mLで再懸濁し、使用前に氷上に保管してください。
2. DNAヘアピンテンションプローブの表面を蛍光顕微鏡(100倍対物レンズ)で品質を確認し、品質管理のためにリガンドを添加したり、細胞をプレーティングしたりします。DNAヘアピンテンションプローブ表面のCy3Bチャネルの平均バックグラウンド強度を、少なくとも5つの異なる位置と3回の繰り返しから画像化し、定量化します。この値を表面品質とプローブ密度の信頼性の高いマーカーとして使用できるように、イメージング取得条件を一定に保ちます(図3C).
   手記：文献によると、表面処理の最初の数回における金ナノ粒子あたりのDNA鎖数とμm²あたりの金ナノ粒子数を定量化します。これは、表面品質の別の信頼性の高いマーカーとして使用できます。
3. ~4 x 10⁴ - 10 x 10^{4 個の}細胞を各DNAテンションプローブ官能基カバースリップにプレートし、室温で~15分間接着および拡散させます。
4. 細胞がDNAヘアピンテンションプローブに播種され、広がり始めたら、Cy3Bチャネルで生成される蛍光シグナルを100倍対物レンズでイメージングします(図2I)。
5. 細胞がCy3BチャネルのDNAヘアピンテンションプローブ表面でリアルタイムのテンションシグナルを産生し始めたら、Cy3BチャネルとAtto647Nチャネルの両方で画像を取得します(全反射蛍光(TIRF)顕微鏡は、落射蛍光よりも優れたS/N比を示します)。続いて、Atto647N鎖を最終濃度200 nMでイメージングチャンバーに添加し、機械的に選択的なハイブリダイゼーションを行います。
6. 10分間のインキュベーション後、蛍光灯Atto647Nロッキングストランドを含むバッファーを迅速かつ穏やかに除去し、新鮮なハンクのバランスの取れた塩と交換します。Cy3B チャネルと Atto647N チャネルの両方で再度画像を取得し、フィジーのソフトウェアでピアソンの相関係数を決定します。
7. 調査対象の時点で、イメージングチャンバー内の細胞に非蛍光性のロッキングストランドを導入して、張力シグナルを格納します。ロッキングストランドストック(100 μM)を調製し、最終濃度1 μMで細胞に加えます。ロックの期間はさまざまですが、10 分が推奨されます。
8. タイムラプス動画または終点画像を落射蛍光で取得し、必要に応じて定性的なテンションマッピングと定量分析の両方を行います(図2Jおよび図4)。
   手記：複数の時点での張力測定が必要な場合は、ロック解除ストランドを追加して、保存された張力信号の消去を開始します。過剰なすすぎを避けるために、アンロックストランドの最終濃度を 2 μM に高めて、ロッキングストランドとのトーホールドを介したストランド変位反応を 3 分間開始し、保存されたシグナルを消去します(図 2J)。余分なオリゴヌクレオチドをHBSSでやさしく洗い流します。DNAヘアピンテンションプローブの表面と細胞は、テンション保存とマッピングの次のラウンドの準備ができています。スタディで関心のある時点が 1 つだけの場合は、張力シグナルのロックを解除する必要はありません。

結果

図1:オリゴヌクレオチド調製例。(A)Cy3Bリガンド鎖精製のHPLCクロマトグラム。(B)製品のMALDI-TOF-MSスペクトル。(C)出発物質と標識オリゴヌクレオチドの計算質量と検出されたm/zピークの表。

図2:DNAテンションプローブ基質の機能化と実験手順。 手順は、対応するプロトコルで説明されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-ヒドロキシピコリン酸(3-HPA)	シグマ	56197	Maldi-TOF-MSマトリックス
mPEG-SC	バイオケムペグ	MF001023-2K	表面処理
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン	アクロス	AC430941000	表面処理
10x 赤血球溶解バッファー	バイオレジェンド	00-4333-57	バッファ
8.8 nm金ナノ粒子、タンニン酸	ナノコンポジックス	カスタマイズされた注文	表面処理
Atto647N NHSエステル	シグマ	18373-1MG-F	フルオロフォア、オリゴ調製
Attofluor Cell Chamber、顕微鏡用	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A7816	イメージング
BDシリンジのみ、ルアーロック付き	BDバイオサイエンス	309657	細胞
ビオチン化抗マウスCD3e	eバイオサイエンス	13-0031-82	抗体/リガンド
ビオチン化pMHCオボアルブミン(SIINFEKL)	エモリー大学のNIHテトラマーコア施設	NAの	抗体/リガンド
ウシ血清アルブミン	シグマ	735078001	非特異的なインタラクションをブロック
セルストレーナー	バイオロジックス	15-1100	細胞
カバースリップ・ミニラック、テフロン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C14784	表面処理
Cy3B NHSエステル	GEヘルスケア	PA63101	フルオロフォア、オリゴ調製
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	コーニング	21-031-CM	バッファ
エタノール	シグマ	459836	表面処理
ハンクのバランス塩(HBSS)	シグマ	H8264-J	バッファ
過酸化水素	シグマ	H1009	表面処理
LA-PEG-SC	バイオケムペグ	HE039023-3.4K	表面処理
Midi MACS(LS)スタートアップキット	ミルテニーバイオテック	〒130-042-301	細胞
マウスCD8+ T細胞単離キット	ミルテニーバイオテック	〒130-104-075	細胞
ナノセップMF遠心分離装置	ポール研究所	ODM02C35	オリゴ調製
No.2丸いガラスカバースリップ	VWRの	48382から085	表面処理
NTA-SAM	同人道分子技術	N475-10	表面処理
P2ゲル	バイオ・ラッド	1504118	オリゴ調製
硫酸	EMDミリポア株式会社	SX1244-6	表面処理
スルホ-NHSアセテート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26777さん	表面処理
備品
Agilent AdvanceBio オリゴヌクレオチド C18 カラム、4.6 × 150 mm、2.7 μm	653950から702		オリゴヌクレオチド調製
Barnstead ナノ純水精製システム	サーモフィッシャー		水
CFI Apo 100× NA 1.49 対物レンズ	ニコン		顕微鏡
Cy5キューブ	彩度		顕微鏡
電子増倍電荷結合素子(EMCCD)を進化	フォトメトリクス		顕微鏡
高速液体クロマトグラフィー	アジレント1100		オリゴヌクレオチド調製
Intensilight落射蛍光源	ニコン		顕微鏡
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF-MS)	ボイジャーSTR		オリゴヌクレオチド調製
Nanodrop 2000 UV-Vis分光光度計	サーモフィッシャー		オリゴヌクレオチド調製
ニコンエクリプスTi倒立顕微鏡	ニコン		顕微鏡
ニコンパーフェクトフォーカスシステム	ニコン		顕微鏡
NIS Elements ソフトウェア	ニコン		顕微鏡
クワッドバンドTIRF 405/488/561/647キューブ	彩度		顕微鏡
RICMキューブ	彩度		顕微鏡
488 nm(50 mW)、561 nm(50 mW)、および640 nmのTIRFランチャー	コヒーレント		顕微鏡
TRITCキューブ	彩度		顕微鏡
オリゴ名	5'修正/ 3'修正	シーケンス (5' から 3')	使う
15merアミンロッキングストランド	5' モディフィケーション: モディフィケーションなし 3'モディフィケーション:/3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	リアルタイム張力信号のロック
15mer Atto647Nロッキングストランド	5フィート改造:Atto647N 3'モディフィケーション:/3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	リアルタイム張力信号のロック
15mer非蛍光ロックストランド	5' モディフィケーション: モディフィケーションなし 3' Modification: 修正なし	A、AAA、AAC、ATT、TAT、AC	定量分析のためのリアルタイム張力信号のロック
4.7 pNヘアピンストランド	5' モディフィケーション: モディフィケーションなし 3' Modification: 修正なし	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC(全米カブ数)	ヘアピンプローブ
アミン配位子鎖	5フィート変更: /5AmMC6/ 3' モディフィケーション: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	ヘアピンプローブ
BHQ2 アンカーストランド	5フィート改質:/5ThiolMC6-D/ 3' モディフィケーション: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	ヘアピンプローブ
Cy3Bリガンド鎖	5'修飾:Cy3B 3' モディフィケーション: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	ヘアピンプローブ
ストランドのロック解除	5' モディフィケーション: モディフィケーションなし 3' Modification: 修正なし	タグ: GTA 、 GGG、 タット、 AAA TGT、 TTT 、 T、 T、 C、	蓄積されたテンション信号の解除