感染マウスのドレナージリンパ節への皮膚樹状細胞の移動を監視するためのCFSEベースのアッセイ

要約

出典:Bollampalli, V. P., et al. A CFSE based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin. J. Vis. Exp. (2016年)

このビデオは、マウスでMycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCGによるフットパッド感染後の樹状細胞の移動をモニタリングするためのアッセイを示しています。細菌感染すると、活性化された皮膚DC細胞は、細胞透過性のカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)色素で標識されます。膝窩ドレーンリンパ節へのDC移動に適した間隔を空けた後、リンパ節細胞を単離し、DC特異的表面マーカーの免疫染色を行います。移行したDCの同定は、フローサイトメトリーを使用して行われます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. CFSEストックとストレージの準備

1. ジメチルスルホキシド中の5-および6-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)の5 mMストックを調製します。渦動。100 μlのアリコートを滅菌済みの0.5 mlスクリューキャップマイクロチューブに分注します。アリコートは-80°Cで保存してください。

2. マウス

1. 生後8週齢から12週齢までの近交系マウスまたは雌マウスを使用してください。性別と年齢が一致した動物が好まれます。実験を開始する前に、必要な動物倫理許可が取得されていることを確認してください。

3. イソフルランガス麻酔による動物の固定化

1. 麻酔ユニットにイソフルランをロードします。10 mLの気密ガラスシリンジにイソフルランを満たします。.気泡の持ち込みを避けてください。シリンジと液体インレットを付属のチューブに接続し、接続チューブ内の液体が気化器に入るのが見えるまでプッシャーを前方に動かします.
   手記：使用しないときは、イソフルランをシリンジに保管しないでください。.
2. 誘導チャンバー内でイソフルランを使用して動物に麻酔をかけ、気流は約400〜500 ml / minに維持され、イソフルランの濃度は3.5%
   手記：ユニットは空気の流れがないと動作しません。
3. 動物が眠ったら、麻酔ユニットのストップコックを回して、イソフルランガスをマスクピースにルーティングします。ガス漏れを防ぐため、マスクピースに損傷がないことを確認してください。エアフローは400 ml / minに維持でき、または200 ml / minに減少します。イソフルラン濃度を2.6%に下げます.
   手記：麻酔効果は、流量を調整することで増減させることができます。

>4. BCGインジェクションとリカバリー

1. 注射を行う前に、マウスがイソフルランマスクピースに固定/眠っていることを確認するためのつま先つまみ反射テストなどのテストを視覚的に確認して実行します。
2. 29 G x 1/2インチの針を取り付けたシリンジを使用して、30 μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にMycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin(BCG)の1 x 10⁶コロニー形成ユニットを後足で接種します
   手記：マイコバクテリアストックの生成は、この手順の元の説明で簡単に説明されており、他の場所ではかなり詳細に説明されています。BCGは、商用ソースからも容易に入手できます。著者らは、BCGをマウスに接種する前に、BCGをパルス超音波処理するか、シリンジに通して凝集体を破壊することを推奨しています。BCGは、このプロトコル3の元の説明で採用されていることから、ここでは微生物刺激として繰り返し述べられていますが、著者は確かに他の微生物刺激のテストを奨励しています。
3. コントロールマウスへのPBSの注入について、上記と同じ手順を実行します。
4. 注射後の動物を観察し、麻酔からの回復が成功していること、および注射された後足パッドで動物が自立できることを確認します。

5. CFSE インジェクション

1. 注射用CFSEの調製
   1. 5 mM CFSEストック溶液のバイアルを-80°Cで解凍し、CFSEをPBSで10倍に希釈します。注射の準備としてシリンジを充填する前に、溶液を完全に再懸濁してください。.
2. CFSE インジェクションとリカバリー
   1. セクション3の動物に麻酔をかける手順を繰り返します。以前にBCGまたはPBSを投与された後足パッドに20μlの0.5 mM CFSEを注入します
      手記： CFSEの注射は、犠牲の予定日の前日(24時間)に行う必要があります。.

>6. 膝窩リンパ節の外科的切除(pLN)

>注:このステップでは、滅菌した手術器具の使用と70%エタノールでの繰り返しの除染が推奨されます。

1. マウスを安楽死させます。動物に70%エタノールをスプレーします。動物を背側の位置に、解剖ボードに固定します.
   手記： 著者は、子宮頸部脱臼による安楽死を推奨することができます。
2. 太ももの後部を慎重に垂直に切開します。ハサミとピンセットを使用して筋肉と脂肪をきれいにし、脂肪ポーチの奥深く、膝のくぼみにあるpLNを露出させ、その結果切除します。
3. 氷上でpLNを0.5 mlの滅菌PBSに移します。

>7. pLNからのシングルセル懸濁液の生成

1. 5 mLのPBSまたは蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー(2%のウシ胎児血清(FCS)、5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および1 mMのアジ化ナトリウムを含むPBS)を含む6ウェルプレートに70ミクロンのセルストレーナーを配置して、pLNをホモジナイズします。3 mLシリンジの後端を使用して、ストレーナーを介して均質化します.
   手記： アジ化ナトリウムは有毒であり、取り扱いには注意が必要です。
2. ストレーナーを別の5 mlのPBSまたはFACSバッファーで洗浄し、材料を15 mLのチューブに集め、細胞を277 x g(1,200 rpm、R = 172 mm)で5分間、4°Cでペレット化します。あるいは、ポリプロピレンホモジナイザーを使用してマイクロ遠心チューブ内で直接pLNを均質化します。
3. ペレットのサイズに基づいて、pLN懸濁液を適切な容量のPBSまたはFACSバッファー(例:200 - 1,000 μl)に再懸濁します。計数チャンバーを使用して、各LN懸濁液から得られる総細胞数を定量化します。トリパンブルーを使用して、死んだ細胞/死にかけている細胞を除外します。

8. 細胞染色とフローサイトメトリー

1. 1 - 10 x 10⁶セルを5 mLの丸底ポリスチレンチューブに移します。FACS緩衝液で洗浄し、ペレットを277 x g(1,200 rpm、R = 172 mm)で5分間、4°Cで遠心分離します。
2. 上清を捨て、0.5 - 1 μgの抗マウスCD16/CD32 (非特異的なFc媒介性相互作用をブロックするため) を含む 50 - 100 μl の抗体カクテル (表面染色に使用される樹状細胞 [DC] マーカー、材料表を参照) にペレットを再懸濁します (非特異的な Fc-媒介性相互作用をブロックするため) FACS バッファーで 30 - 45 分間、氷上。サンプルを光から保護します。
3. インキュベーション後、細胞をFACSバッファーおよびペレットで277 x g(1,200 rpm、R = 172 mm)で5分間、4°Cで遠心分離して細胞を洗浄します。
4. 細胞を50 - 100 μlのFACSバッファーに再懸濁します。フローサイトメーターでデータを取得します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イソフルラン	バクスター	1001936060
5-および6-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)	インビトゲン	C1157
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ	D2650
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ	F7524
カルメット・ゲラン (BCG)			パスツール菌、自社製
トリパンブルー溶液	シグマ	T8154
EDTAの			社内
アジ化ナトリウム	シグマ	S2002
PBSの			社内
ろ過水			社内
BD Plastipak 3 ml シリンジ	BDメディカルサージカルシステム	309658	代替案:5mlシリンジ
6ウェルプレート	TPPとは	92006
15ml遠心分離管	TPPとは	91015	ポリプロピレン
5ml丸底チューブ	BDファルコン	3272948	ポリスチレン
ユニベントール400麻酔ユニット	ユニベントール	8323001
モノジェット3 / 10mlシリンジ	メディキャリア	8881511144	29 G x 1/2 インチ
滅菌フィルターユニット	TPPとは	99500	PESメンブレン
EPPI-ピスティルホモジナイザー	Schuettバイオテクノロジー	3.200 512	ポリプロピレン
アレグラX-30R遠心分離機	ベックマン・コールター	B01145
Bürker計数室	VWRの	〒631-0920
0.5 ml スクリューキャップマイクロチューブ	ザルシュテット	72円73	ポリプロピレン
1.5 ml エッペンドルフ微量遠心チューブ	VWRの	〒700-5239	ポリプロピレン
70ミクロンセルストレーナー	VWRの	〒734-0003
FlowJo細胞解析ソフトウェア	ツリースター
抗体	クローン	会社
抗体
MHC-II I-A/I-E	M5/114.15.2	BDバイオサイエンス
CD11bの	M1/70	BDバイオサイエンス
CD11c	HL3	BDバイオサイエンス
CD16/CD32 (Fcブロック)	2.4G2	BDバイオサイエンス
CD326/エプキャム	G8.8	バイオレジェンド
CD103	2.00E+07	バイオレジェンド
CD80	16-10A1	バイオレジェンド
CD86	GL-1	バイオレジェンド

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