出典:Brunel, S. F. et al., A. fumigatusに応答したヒト初代好中球および単球による抗真菌活性のライブイメージング。J. Vis. Exp.(2017年)
このビデオは、蛍光アスペルギルスレポーター分生子を使用してヒト好中球の抗真菌活性を分析するためのライブセルイメージングを示しています。最初に、好中球内では赤色とマゼンタの両方の蛍光が検出されますが、赤色の蛍光は時間とともに減少し、分生子の劣化を示し、好中球の抗真菌活性を確認します。
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方法論記事
初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. A. fumigatus 文化と条件
- 記載されているように、グルコース最小寒天培地を調製します。
- 1 M水酸化ナトリウム(NaOH)を使用して培地をpH 6.5に調整し、120°Cで20分間オートクレーブします。
- 65°Cに冷まします。
- 滅菌フローフードで作業し、冷却した媒体30 mLをT75フラスコに注ぎ、フラスコの首を25 mLピペットに置いた状態で冷まして寒天スロープを作成します。
- 寒天上のdsRed Af293-Aspergillus fumigatus株をストリークアウトし、37°C + 5%二酸化炭素(CO2)で7日間インキュベートします。2つのフラスコは、5mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)プレビオチン化中に約109分生子を生成します。
>2. A. fumigatus 標識と調製
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| グリセロール | シグマ | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75フラスコ | グライナーバイオワン | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBSの | ギブコ | 20012年019 | https://www.thermofisher.com/ |
| トゥイーン-80 | フィッシャーサイエンティフィック | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40μmフィルター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15mlファルコンチューブ | グライナーバイオワン | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50mlファルコンチューブ | グライナーバイオワン | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| ミリク | ミリポア | QGARD00R1 | ナノピュアウォーターも同様に機能します。 |
| ビオチン | 分子プローブ | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSOの | シグマ | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| ストレプトアビジン-AF633 | 分子プローブ | S-21375 | AF633は、これまでに試験された唯一の蛍光色素であり、ファゴソームで観察可能なままです。 |
| EDTA血液チューブ | グライナーバイオワン | 455036 | 抗凝固剤を含む血液チューブはどれでも機能するはずです。 |
| フィコール・パケ・プラス | GEヘルスケア | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| トリパンブルー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSSの | ギブコ | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14マイクロビーズ | ミルテニ・バイオテック | 〒130-050-201 | 他の単球単離法も同様に使用することができ、我々はこの方法を好む、なぜならそれは労働集約的ではなく、単球の一貫した高純度を与えるからである。 |
| MS カラム | ミルテニ・バイオテック | 〒130-042-201 | CD14マイクロビーズのコメントを参照してください。 |
| RPMI + グルタマックス | ギブコ | 〒72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2に依存しない媒体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 18045054 | イメージング中に十分なCO2交換がない場合に必要です https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| μスライド8ウェルガラスボトム | イビディ | 80827 | これは私たちが使用するイメージングディッシュですが、適切なサイズのガラスイメージングディッシュであれば何でも機能するはずです。 |
| UltraVIEW VoX 3Dライブセルイメージングシステム | パーキン・エルマー | L7267000 | 集録および解析用のvolocityソフトウェアが含まれています。 |
