初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価

要約

出典:Brunel, S. F. et al., A. fumigatusに応答したヒト初代好中球および単球による抗真菌活性のライブイメージング。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、蛍光アスペルギルスレポーター分生子を使用してヒト好中球の抗真菌活性を分析するためのライブセルイメージングを示しています。最初に、好中球内では赤色とマゼンタの両方の蛍光が検出されますが、赤色の蛍光は時間とともに減少し、分生子の劣化を示し、好中球の抗真菌活性を確認します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. A. fumigatus 文化と条件

1. 記載されているように、グルコース最小寒天培地を調製します。
   1. 1 M水酸化ナトリウム(NaOH)を使用して培地をpH 6.5に調整し、120°Cで20分間オートクレーブします。
   2. 65°Cに冷まします。
   3. 滅菌フローフードで作業し、冷却した媒体30 mLをT75フラスコに注ぎ、フラスコの首を25 mLピペットに置いた状態で冷まして寒天スロープを作成します。
2. 寒天上のdsRed Af293-Aspergillus fumigatus株をストリークアウトし、37°C + 5%二酸化炭素(CO₂)で7日間インキュベートします。2つのフラスコは、5mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)プレビオチン化中に約10⁹分生子を生成します。

>2. A. fumigatus 標識と調製

注:このアッセイを初めて実施するときは、親のAf293-A.fumigatus株を準備してください。両方の菌株のサンプルを微量遠心チューブで採取し、以下に説明するように各菌株の1つだけを標識します。これにより、色のない制御分生子と単色の分生子(dsRedまたはAlexa Fluor 633(AF633))を使用して、セットアップと機器をテストできます。

1. A. fumigatus conidiaを30 mL PBS + 0.05% Tween-80で培養液に浸漬して収穫します。得られた懸濁液を40 μmの細胞ストレーナーで50 mLのチューブにろ過し、菌糸断片を除去します。
2. 805 x gで10分間遠心分離し、上清を取り除き、20 mLの滅菌PBSで1回洗浄します。洗浄ステップ中に同じ株の2つのプレートから分生子をプールします。
3. 洗浄ステップの後、ペレットを5 mLのPBSに再懸濁し、1 mLの分生子懸濁液を微量遠心チューブに移します。通常、生細胞イメージングには各菌株の懸濁液1 mLで十分です。残りのアリコートをホイルで包み、4°Cで保存します。
4. 分生子懸濁液の分液を9,300 x gで室温で10分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。分生子ペレットを1 mLの0.05 M重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)pH 8.3に再懸濁します。
5. 25 mgのビオチンを500 μL DMSOに再溶解することにより、10 mgのビオチン/200 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)原液を調製します。10 μLのビオチン/DMSOストック溶液を微量遠心チューブに加え、アルミホイルで覆い、ロッカー上で4°Cで2時間インキュベートします。
   1. 残りのビオチン/DMSOストック溶液を分注し、その後の実験で使用するために-20°Cで凍結します。
6. 9,300 x gで10分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。分生子ペレットを1 mLの100 mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl)pH 8.0に1時間再懸濁して、遊離ビオチンを不活性化します。
7. 9,300 x gで10分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。ペレットを1 mLの滅菌PBSで2回洗浄し、ペレットを1 mLのPBSに再懸濁します。
8. 1 mgのストレプトアビジン-AF633を0.5 mLのPBSに溶解して、2 mg / mLのストック溶液を作ります。.分生子懸濁液1 mLあたり2 mg/mLストレプトアビジン-AF633 10 μLを添加し、アルミホイルで覆われたロッカー上で室温で40分間インキュベートします。残りのストレプトアビジン-AF633は、その後の実験で使用するためにアリコートで凍結することができます。
9. 9,300 x gで10分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。分生子ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、血球計算盤を使用して1:1,000希釈(1:100、次に1:10)で分生子をカウントします。CO_{2-independent} mediaで分生子濃度を3.6 x 10⁶/mLに調整し、ホイルで包んで4°C.
   で保存します。 手記：分生子は現在AF633でラベル付けされており、FLuorescent Aspergillus REporter(FLARE)分生子と呼ばれます。
10. オプション:分生子の膨潤による刺激が必要な場合は、分生子のカウント後(ステップ2.9)、分生子を酵母窒素ベース(YNB)培地で7.2 x 10⁶/mLに希釈し、オートクレーブ処理した50 mL三分生子フラスコ中の4.5 mL YNB培地に500 μLの分生子懸濁液を加えます。フラスコをふたをして、振とうのあるインキュベーター(37°Cで200rpm)に6時間置きます。
    1. 培地を15mLチューブに移します。805 x gで室温で10分間遠心分離し、PBSで1回洗浄します。再度遠心分離し、ペレットを 1 mL の CO₂ 独立培地に再懸濁し、3.6 x 10⁶ 分生子/mL.
       を得ます。 注:分生子は、正確なカウントを困難にするために腫れた後、頻繁に凝集し、使用される休息分生子の数で計算することをお勧めします。

3. ヒト好中球と単球の単離

1. 健康なボランティアから20mLの静脈血を、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む2本の10mL血液チューブに採取します。ドナーごとに別々に、20 mLの血液を50 mLのチューブに注ぎ、15 mLのPBSで希釈します。
2. 15 mLのリンパ球単離溶液(密度1.077 g / mL)で血液を下敷きにし、注射器と鉄針を使用します。針をチューブの底に置き、リンパ球単離溶液を静かに押し出します。630 x gで20分間、ブレーキなし、低加速で遠心分離します。
3. PBSを氷の上で冷やして準備します。
   手記：単球(3.4)と好中球(3.5)を生成するには、ステップ3.4と3.5を同時に実行する必要があります。
4. パスセットを使用して、末梢血単核細胞(PBMC)層を採取します。黄色い血清(上)と透明なリンパ球分離液(下)の中間にある層で、新鮮な50mLチューブに移します。
   1. チューブにPBMCを最大50mLの冷たくしてPBSで満たし、582×gで10分間遠心分離します。上清を取り除き、冷たいPBSで2回洗浄し、最初に使用したドナー血液20mLあたり1mLのPBSに再懸濁します。
   2. 160 μLのPBSおよび20 μLのトリパンブルーに20 μLの細胞懸濁液を加えて、計数用に1:10希釈します。血球計算盤で細胞をカウントします。
   3. 500 mLのハンク平衡塩溶液(HBSS)に、26 mLの熱不活化ウシ胎児血清(FCS)と2.1 mLの0.5 M EDTAを加えて緩衝液を調製します。細胞を515 x gで10分間遠心分離し、1 x 10⁷細胞あたり40 μLの緩衝液に再懸濁します。
   4. 細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、1 x 10⁷細胞あたり10 μLのCD14マイクロビーズを加え、よく混合し、4°Cで15分間インキュベートします。
   5. 1 x 10⁷細胞あたり1 mLの緩衝液を加えて細胞を洗浄し、515 x gで10分間遠心分離します。
   6. 上清を完全に吸引し、500 μLの緩衝液中に最大1 x 10⁸細胞を再懸濁します。
   7. サンプルごとに1カラムをマグネティックセパレーターにセットします。まず、カラムを500 μLの緩衝液で1回洗浄します。
   8. 500 μLの細胞懸濁液をカラムにピペットで入れ、カラムが乾くのを待ってから、これを緩衝液で3回繰り返して洗浄します。
   9. 新しい 15 mL チューブをカラムの下に置き、カラムをマグネティックセパレーターから外します。次に、カラムから細胞を1 mLの緩衝液でチューブに洗い流します。
   10. 4 mLの緩衝液を加え、515 x gで10分間遠心分離した後、1 mLのロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)培地に再懸濁します。
   11. 160 μLのPBSおよび20 μLのトリパンブルーに20 μLの細胞懸濁液を加えて、計数用に1:10希釈します。血球計算盤で細胞を数えます。
   12. RPMIで細胞濃度を6 x 10⁵/mLに調整し、35 mmガラスベースのイメージングディッシュで200 μLを播種します。5% CO₂ で 37 °C で一晩インキュベートします。
   13. 翌日、イメージングの前に、RPMIを取り外し、CO2に依存しない培地200μLを追加します
       手記：これらの単球は、イメージングの前にさまざまなマクロファージサブセットに分化することもできます。これが探求すべき手法であるならば、優れた出発点はOhradanova-Repicらによる最近の論文です。
5. PBMC層を採取した後、すべての血清とリンパ球分離溶液の大部分を取り除きますが、赤いペレットの上にある小さな白いバンドには好中球のほとんどが含まれているため、取り除かないように注意してください。
   1. 1 Lの滅菌水に83 gの塩化アンモニウム(NH₄Cl)と10 gの重炭酸カリウム(KHCO₃)を加えて、10倍低張溶解バッファーストックを調製します。4°Cで保存してください。
   2. このストックを滅菌水で10倍に希釈し、チューブに加えます。次に、慎重に3回反転させ、氷で15分間インキュベートします。
   3. 394 x gで10分間遠心分離し、氷中で10分間低張溶解バッファーに再懸濁します。
   4. 394 x gで遠心分離し、冷たいPBSで2回洗浄します。ドナー1人あたり1 mLのCO₂非依存培地に再懸濁します。
   5. 160 μLのPBSおよび20 μLのトリパンブルーに20 μLの細胞懸濁液を加えて、計数用に1:10希釈します。血球計算盤で細胞を数えます。
   6. 顕微鏡検査の場合は、同じ細胞懸濁液200 μLを35 mmガラスベースのイメージングディッシュに加えます。
      注:好中球イメージングまたはフローサイトメトリーは、刺激を受けないままにしておくとアポトーシスを起こす傾向があるため、すぐに開始する必要があります。これが不可能な場合は、好中球を氷の上に置いて、できるだけ早く(同じ日中に)使用する必要があります。

>4. ライブセルビデオ顕微鏡

>注: 顕微鏡の選択は、現地で利用可能なものによって異なりますが、顕微鏡のセットアップには、逆ステージ、37 °C に加熱された環境チャンバー、dsRed (532/561 nm) と AF633 (633 nm) 用の適切な励起/発光フィルターを含める必要があります。FLARE 分生子は、dsRed の 532/561 nm レーザーの代わりに 488 nm レーザーでは動作しません。この実験を初めて行う場合は、無色および単色のコントロール分生子を使用して、dsRedチャネルとAF633チャネル間のバックグラウンド蛍光およびブリードスルーをテストします。

1. 実験前に顕微鏡ヒーターをオンにし、環境制御チャンバーが37°Cに温まるまで十分な時間を確保してください。チャンバーの温度が安定するのにかかる時間は、顕微鏡のセットアップによって異なります。
2. 顕微鏡とコンピューターの電源を入れ、イメージングソフトウェアをロードします。イメージングディッシュを顕微鏡ステージに取り付け、ピントを調整してヒト好中球または単球を見つけます。
3. dsRedおよびAF633の場合、取得設定でレーザー出力を10%に、露光時間を1秒に設定します。
4. イメージングスライドを取り外し、100 μL の 3 x 10⁶/mL FLARE 分生子懸濁液を適切なウェルに加えます (総容量 300 μL/ウェル)。FLARE 分生子がディッシュに追加された時間を記録します。
5. スライドをステージに戻し、dsRedとAF633のカメラ感度を調整して、分生子をはっきりと見ますが、画像が露出オーバーにならないようにします。マルチポイント取得が必要な場合は、ステージポイントリストを設定します。
6. すべてのポイントにピントが合い、チャンネルが最適化され、サイクルタイムと期間が設定されたときにイメージングを開始します。イメージングのサイクルタイムと期間は、実験的な問題によって異なります。目標は、サイクルタイムをできるだけ短く(≤2分)、1分にして、取り込みダイナミクスの詳細な分析を可能にすることです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
グリセロール	シグマ	G6279	http://www.sigmaaldrich.com
T75フラスコ	グライナーバイオワン	658 175	http://www.greinerbioone.com/
PBSの	ギブコ	20012年019	https://www.thermofisher.com/
トゥイーン-80	フィッシャーサイエンティフィック	10592955	https://nl.fishersci.com/
40μmフィルター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	22363547	https://www.thermofisher.com/
15mlファルコンチューブ	グライナーバイオワン	188 261	http://www.greinerbioone.com/
50mlファルコンチューブ	グライナーバイオワン	227 261	http://www.greinerbioone.com/
ミリク	ミリポア	QGARD00R1	ナノピュアウォーターも同様に機能します。
ビオチン	分子プローブ	B-6352	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
DMSOの	シグマ	D5879	http://www.sigmaaldrich.com
ストレプトアビジン-AF633	分子プローブ	S-21375	AF633は、これまでに試験された唯一の蛍光色素であり、ファゴソームで観察可能なままです。
EDTA血液チューブ	グライナーバイオワン	455036	抗凝固剤を含む血液チューブはどれでも機能するはずです。
フィコール・パケ・プラス	GEヘルスケア	17-1440-03	http://www3.gehealthcare.com/
トリパンブルー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SV3008401	https://www.thermofisher.com/
HBSSの	ギブコ	14170112	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
CD14マイクロビーズ	ミルテニ・バイオテック	〒130-050-201	他の単球単離法も同様に使用することができ、我々はこの方法を好む、なぜならそれは労働集約的ではなく、単球の一貫した高純度を与えるからである。
MS カラム	ミルテニ・バイオテック	〒130-042-201	CD14マイクロビーズのコメントを参照してください。
RPMI + グルタマックス	ギブコ	〒72400-021	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
CO2に依存しない媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	18045054	イメージング中に十分なCO2交換がない場合に必要です https://www.thermofisher.com/uk/en/home
μスライド8ウェルガラスボトム	イビディ	80827	これは私たちが使用するイメージングディッシュですが、適切なサイズのガラスイメージングディッシュであれば何でも機能するはずです。
UltraVIEW VoX 3Dライブセルイメージングシステム	パーキン・エルマー	L7267000	集録および解析用のvolocityソフトウェアが含まれています。

の 月