ビーズ担持脂質二重膜を用いたT細胞からのシナプス出力の調査

要約

出典:Céspedes, P. F., et al. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、ビーズ支持脂質二重膜による合成抗原提示細胞の再構成と、活性化T細胞によって生成されたシナプス出力の評価におけるそれらの応用を示しています。

プロトコル

1. BSLBs(ビーズ支持脂質二重膜)のタンパク質密度較正

1. 直径5.00 ±0.05 μmの非機能化シリカビーズを採取する前に、ストック溶液をよく混合し、フラスコの底に沈殿したビーズの大きな塊を再懸濁します
   注:シリカビーズは急速に沈殿する傾向があり、カウントエラーにつながる可能性があります。P1000マイクロピペットの最大容量の半分をピペッティングして激しく混合します。
2. 1 μL のビーズ溶液を 1,000 μL の PBS で希釈し、血球計算盤チャンバーを使用してビーズをカウントし、mL あたりの濃度を計算します
   手記：トリパンブルー染色は、シリカビーズの可視化には必要ありません。
3. 滴定のポイントごとに5 ×^{10 5}の最終BSLBに必要なシリカビーズの量を計算します。
4. 必要量のシリカビーズを滅菌済みの1.5 mL微量遠心チューブに移します。
5. シリカビーズを1 mLの滅菌PBSで3回洗浄し、ベンチトップマイクロ遠心分離機でRT(固定rpm)でビーズを15秒間遠心分離します
   注意: 洗浄液を取り除くときは、ビーズペレットを乱さないでください。小さなバッファーカラムは、リポソームマスターミックスを構成するリポソームの広がりに影響を与えません。これらはPBSにもあります。
6. 洗浄したシリカビーズ上にBSLBを組み立てるために、3容量のリポソームマスターミックスを調製します(たとえば、シリカビーズの初期総量が20μLの場合、最低60μLのリポソームマスターミックスを調製します)。
7. ビオチニルキャップPEモル%滴定用
   1. Biotinyl Cap PEの5倍希釈液を含む脂質マスターミックスを調製します。
      1. 0.4 mM Biotinyl Cap PE mol%を100% DOPCマトリックスで希釈します。
      2. 各 Biotinyl Cap PE mol% 滴定ポイントを 0.4 mM 25% DGS-NTA(Ni) 溶液と 1:1(vol:vol)比で混合し、最終的に 12.5 mol% の Ni 含有脂質がすべての滴定に存在するようにします
         手記：Ni含有脂質の12.5 mol%(vol:vol%)は、Hisタグ付きタンパク質を並行して試験できるBSLBの混合脂質組成を表しています。例えば、すべてのリポソームストックは同じモル濃度で調製されるため、最終リポソーム混合物200μLで目標mol%混合物に到達するには、25 mol%のNi含有DGS-NTA100 μLと100 μLの100 mol%DOPCを単純に混合します。
   2. 5 ×^{10 5} 5 洗浄シリカビーズを 1.5 mL の微量遠心チューブに移し、チューブごとに 1 つの Biotinyl Cap PE mol% 滴定ポイントが組み立てられます。
   3. 洗浄したシリカビーズにBiotinyl Cap PEモル%滴定マスターミックスを加え、全容量の半分をピペッティングして穏やかに混合します。脂質二重層を過剰に破壊する気泡の形成を避けてください。
   4. 現在形成されているBSLBを含むチューブにアルゴン(または窒素)ガスを追加して、空気を置換し、混合中の脂質を酸化から保護します。
   5. 保存前に0.4 mMの脂質ストックにアルゴンを添加し、滅菌技術を用いて操作してください
      手記： 小さなチューブをアルゴン/窒素ガスボンベに接続します。チューブにガスを追加する前に、圧力が2psiを超えないようにガスボンベレギュレーターを調整します。滅菌ピペットチップをアウトレットチューブに接続して、ガス流をリポソームストック内に5秒間向け、蓋をすばやく閉じます。脂質ストックの場合は、チューブの蓋をパラフィンフィルムで密封してから4°Cで保存してください。
   6. BSLBを垂直の可変角度実験室ミキサー(材料の表を参照)に移動し、10 rpm><の軌道混合を使用してRTで30分間混合します。 手記：このステップにより、支持脂質二重層の形成中にビーズが沈降するのを防ぎます。
   7. ベンチトップミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してビーズをスピンダウンし、その後、1 mLのHBS/HSA(BSA)で3回洗浄して余分なリポソームを除去します。
   8. 1 mL の 5% カゼインまたは 100 μM の NiSO₄ を含む 5% BSA を添加して NTA 部位を飽和させ、200 nM ストレプトアビジンを添加して BSLB 上のすべてのビオチン固定部位を均一にコーティングすることにより、形成された BSLB をブロックします。全容量の半分をピペッティングして穏やかに混合し、垂直ミキサーで室温と10rpmで20分以内にインキュベー
   トします。
   9. ベンチトップミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してBSLBをスピンダウンし、1 mLのHBS/HSA(BSA)バッファーで3回洗浄します
      手記：BSLBを覆う少量の洗浄バッファーを使用して、洗浄したビーズを垂直に保ちます。 空気が脂質二重層を破壊するため、BSLBの脱水は避けてください。
8. 12.5 mol%のDGS-(Ni) NTA含有BSLB上でのHisタグ付きタンパク質の滴定
   1. DGS-NTA(Ni)の最終12.5 mol%を含む3容量のリポソームマスターミックスを調製します。
   2. リポソームマスターミックスを使用して、洗浄したシリカビーズを再懸濁し、全容量の半分をピペッティングして穏やかに混合します。脂質二重層を過剰に損傷する気泡の形成を避けてください。
   3. 現在形成されているBSLBを含むチューブにアルゴン(または窒素)ガスを追加して、空気を置換し、混合中の脂質を酸化から保護します。
   4. 保存前に0.4 mMの脂質ストックにアルゴンを添加し、滅菌技術を用いて操作します。
   5. BSLBを垂直ミキサーに移動し、10rpmの軌道混合を使用してRTで30分間混合します。
   6. ベンチトップミニ遠心分離機でRTで15秒間遠心分離してビーズをスピンダウンし、その後、1 mLのHBS/HSA(BSA)で3回洗浄して余分なリポソームを除去します。
   7. 100 μM の NiSO4 を含む 5% カゼイン (または 5% BSA) を 1 mL 添加して、形成された BSLB をブロックします。穏やかに混合し、垂直ミキサーで RT および 10 rpm で 20 分以内にインキュベー
   トします。
   8. HBS / HSA(BSA)を使用して3回洗浄し、余分なブロッキング溶液を取り除きます。
   9. 新しいU底96ウェルプレートに、タンパク質の2倍段階希釈液を調製します。
      1. 全容量200 μLのHBS/HSA(BSA)バッファーに目的のタンパク質の開始濃度100 nMを調製し、この溶液100 μLを最初のカラムに分配し、残りの100 μLを100 μLのHBS/HSA(BSA)バッファーを含むカラム#2の上部に分配します。
      2. 続けて、カラム#2からカラム#3に100μLを連続的に移し、必要に応じて繰り返してすべての滴定ポイントをカバーします。シリーズの最後のカラムは、定量のためのブランクリファレンスとして使用されるため、タンパク質を含まないままにしておきます。
   10. 調製したBSLBを、5×10個の^5BSLBが100μLのHBS/HSA(BSA)バッファーに含まれるように、容量に再懸濁します。
   11. 100 μL の BSLB 懸濁液を 2 番目の U 底 96 ウェル プレートのウェルに移し、各ウェルが 5 × 10⁵ BSLB を受け取るようにします。
   12. BSLBを含む2番目のプレートを300 × gとRTで2分間スピンダウンし、上清を捨てます。
   13. タンパク質滴定プレートから沈殿したBSLBを含むプレートに100 μLの容量を移します。ピペッティング中に過剰な気泡が発生しないように穏やかに混合し、プレートシェーカーを使用して室温および1,000 rpmで30分間インキュベートします。アルミホイルで光から保護します。
   14. プレートをHBS/HSA(BSA)緩衝液で300 × gの沈降ステップを使用して、室温で2分間3回洗浄します。
   15. キャリブレーションに使用した組換えタンパク質が蛍光色素に直接結合しており、F/P値がわかっている場合。
   16. キャリブレーションに使用した組換えタンパク質が標識されていないか、蛍光色素に結合している場合、またはMESFビーズ標準が利用できない場合は、既知のF/P値を持つAlexa Fluor 488または647標識抗体を使用して、タンパク質でコーティングされたBSLBを染色してください。
   17. 定量抗体の飽和濃度で染色.
       注:ターゲット発現レベルにもよりますが、これらは5〜10μg/mLの範囲です。
   18. プレートシェーカーを使用して、室温および1,000rpmで30分間染色します。アルミホイルを使用して光から保護します。
   19. HBS/HSA(BSA)バッファーで2回、PBSで1回、300 ×gの沈降ステップで2分間RT.
       手記：PBS、pH 7.4を使用して、取得前に洗浄したBSLBを再懸濁してください。タンパク質を含むバッファーは、ハイスループットサンプラーによるサンプルの自動混合中に気泡が形成されるため、使用しないでください。
   20. 図 1B(vii)に示すように、最も明るいピークが定量検出器(チャンネル)の線形検出範囲に留まることを確認し、MESF 標準を取得します。
   21. サンプルは手動で取得するか、HTSを使用して取得します。後者を使用する場合は、BSLBを100μLのPBSに再懸濁し、2.5〜3.0μL / sの流量、100μLの混合量(または再懸濁量が少ない場合は総容量の50%)、150μL / sの混合速度、および5回の混合を使用して80μLを取得し、BSLBがモノ分散されるようにします。
   22. FCS ファイルをエクスポートします。
   23. 分析では単一の事象に焦点を当てます(図2A)、ダブレットまたはトリプレットは決定にエラーをもたらすためです。プロトコルのステップ 1.2.3 に示されているように、単一イベントのネストされた ID を使用します。
   24. 各MESFフラクション(1-4)のMFIを測定し、ブランクビーズのMFIを減算して、補正されたMFI(cMFI)を抽出します。
   25. 線形回帰分析を実行して、MESF 標準に対して計算された cMFI に対する MESF の傾き (b) を抽出します。
   26. 各滴定ポイントのMFIを抽出し、タンパク質を含まないビーズのMFIを差し引いてcMFIを取得します。
   27. cMFI を計算された傾きで除算して、各滴定ポイントの BSLB にバインドされた MESF を抽出します。
   28. BSLBに結合したMESFを定量抗体のF / P値で割って、BSLBごとに結合した分子の平均数を抽出します。
   29. BSLBの直径(5.00 ± 0.05 μm)を使用して、ビーズ表面積(SA = 4pr2)を抽出し、滴定ポイント(タンパク質濃度)あたりのタンパク質の最終密度(molec./μm²)を計算します。
   30. タンパク質密度に対するタンパク質濃度の新しい回帰分析を実行して、最適な線の傾き (b) を計算します。
       手記： DGS-NTA(Ni)の濃度が12.5 mol%の場合、T細胞の非特異的活性化を誘導したり、SLBの横方向の移動性に影響を与えたりすることなく、最大約10,000 molec./μm2 10の固定能力が得られます。

2. T細胞とBSLB間のシナプス導入実験の実施

1. シナプス導入実験を行う前に
   1. 非蛍光BSLB、蛍光脂質を含むBSLB、未染色細胞(またはコンペンセーションビーズ、材料表を参照)、および単色染色細胞(またはコンペンセーションビーズ)を取得して、機器の蛍光スペクトル相互作用を特定します。スピルオーバーの広がりが大きい検出器に焦点を当てて、多色パネルを再設計し、感度を向上させ、重要な検出器の測定誤差を減らします。
   2. 検出抗体を滴定して最適な濃度を見つけることで、陰性の検出を損なうことなく陽性イベントの検出を可能にします
      手記：抗体ロットが変化するたびに、F/P値と輝度がバッチごとに異なるため、この手順を繰り返します。
   3. オプション:異なる電圧範囲でサンプルを集録し(電圧ウォーク)、最適なシグナルオーバーノイズにつながるPMTを見つけることにより、PMT電圧を最適化します(つまり、最も明るい母集団の信号が線形範囲に留まるようにしながら、ネガティブとポジティブを分離します)。
2. BSLBへのTセル出力転送の測定
   1. 10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100μMの非必須アミノ酸、10mM HEPES、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100U/mlのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンを含む補充されたRPMI 1640(本明細書ではR10培地)を調製する。R10培地を使用して、T細胞を培養および増殖します。
   2. 1日目に、末梢血または白血減少システム(LRS)チャンバーからT細胞を単離します。ヒトCD4+およびCD8+ T細胞の濃縮には、免疫密度細胞単離および分離キット(材料表を参照)を使用してください。
   3. 1.5〜2.0の最終濃度で細胞を10⁶細胞/mL×播種し、ウェルあたり合計5 mL以下の6ウェルプレートを使用します。
   4. 1:1の比率のヒトT細胞活性化(抗CD3/抗CD28)磁気ビーズ(材料表を参照)を使用してT細胞を活性化し、100 IUの組換えヒトIL-2を添加して細胞の増殖と生存をサポートします。
   5. 3日目に、磁気カラムを使用して活性化磁気ビーズを除去します(材料の表を参照)。追加の洗浄ステップのために細胞を回収する前に、磁気ビーズがチューブの側面に付着したままであることを確認してください。
   6. マグネティックビーズを5mLの新鮮なR10培地でもう一度洗い、よく混ぜてマグネットに戻します。このボリュームを回収し、ステップ1.2.5で回収した細胞と混合します。
   7. IL-2 を 100 U/mL 含有する新鮮な R10 で、細胞を 1.5-2 × 10⁶ 細胞/mL に再懸濁します。IL-2の最後の添加が実験日(培養の7日目から14日目)の48時間前であることを確認してください、48時間後に培地を補充します。
   8. シナプス導入実験の日に、Phenol Red-free RPMI 1640培地に10% FBS、100 μMの非必須アミノ酸、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、100 U/mLのペニシリン、および100 μg/mLのストレプトマイシンを添加して、シナプス転写アッセイ培地を調製します。組換えヒトIL-2は含まないでください。
   9. トリパンブルー染色または電電流排除のいずれかを使用して細胞をカウントし、培地中の最終濃度2.5 × 10⁶細胞/mLまで再懸濁します。過剰な細胞死が観察された場合(>10%)は、次のように多糖類とジアトリゾ酸ナトリウムの混合物を使用して死細胞/死死細胞を除去します(材料の表を参照)。
      1. 13 mLの多糖類-ジアトリゾートナトリウム溶液の上に15 mLの細胞培養物を重ねます。
      2. 1,250 × gをRTで20分間遠心分離し、加速と減速を最小限に抑えます。培地と多糖類-ジアトリゾ酸ナトリウム溶液との間の界面に細胞層(雲)を収集します。
      3. 予熱したSynaptic Transfer Assay培地(ステップ1.2.7で調製)で細胞を少なくとも2回洗浄します。
      4. シナプストランスファーアッセイ培地を使用して、細胞をカウントし、最終濃度2.5 × 10⁶/mLまで再懸濁します。この細胞懸濁液100μLをBSLBと共培養します(ステップ1.2.15を参照)。
   10. 実験に必要なBSLBの数を計算し、試験するさまざまなタンパク質マスターミックスと抗原滴定(ビオチン化HLA/MHCペプチドモノマーまたはモノビオチン化抗CD3εFab)をすべて考慮します。
   11. プロトコルセクション5と同じ手順に従ってBSLBを組み立てますが、今回は、複雑なAPCメンブレンを再構成するために必要なタンパク質と脂質のすべての滴定を組み合わせます(図3A)。同じvol:初期のシリカビーズの量とキャリブレーション中に使用されるタンパク質混合物の量、およびBSLBのロードに使用される時間と温度との間のvolの関係を維持します。例えば、初期キャリブレーションに0.5 μLのシリカビーズ/ウェルと100 μL/ウェルのタンパク質ミックスを使用した場合、5:1,000 vol:vol 比を維持して、BSLB を T 細胞と共培養する準備をします。
   12. BSLBに目的のタンパク質ミックスをロードしたら、BSLBをHBS / HSA(BSA)で2回洗浄して、余分な未結合タンパク質を取り除きます。各洗浄ステップでRTで300 × gの沈降速度を2分間使用し、上清を廃棄します。
   13. ウェルあたり5 × 105 BSLBを200 μLに再懸濁します。
   14. ウェルあたり 100 μL を新しい U 底 96 ウェルプレートに移して複製を作成し、ウェルあたりの BSLB の最終量が 2.5 × 10⁵
   になるようにします。
   15. BSLBを300 × gで2分間スピンダウンし、RTし、上清を捨てます。
   16. 100 μL の T 細胞懸濁液を使用して BSLB を再懸濁し、気泡の形成を防ぐために穏やかに混合します。
   17. 共培養物を37°Cで90分間インキュベートします
       手記： あるいは、細胞とビーズをフェノールレッドフリーRPMIの代わりにHBS/HSA(BSA)バッファーに再懸濁して共培養することもできます。この場合、インキュベートは非_CO2インキュベーターで行わなければなりません、なぜならこのガスは重炭酸塩の非存在下で緩衝液を急速に酸性化します。
   18. 最初に細胞をRTで最低15分間インキュベートすることにより、BSLB-T細胞共培養を冷却します。
   19. 細胞を500 × gで5分間遠心分離し、RTし、上清を捨てます。
   20. 細胞をRT 2% BSA-PBS(Ca₂⁺およびMg₂⁺フリー)に再懸濁してブロッキングします。細胞を氷の上に45分間置きます。光から保護してください。
   21. 細胞をインキュベートしながら、PBS中の氷冷0.22μmろ過2%BSAを染色バッファーとして使用して抗体マスターミックスを調製します。これにより、追加のブロッキングが得られます
       手記：Brilliant Violet色素に結合した抗体の一部のバッチは、BSLBに非特異的に結合する傾向があります。5% BSA-PBSでブロッキングすると、このノイズを減らすのに役立ちます。これからは、コールドチェーンを切れないようにしてください。
   22. 共培養液を500 × gで5分間、4°Cでスピンダウンします。上清を捨てる前に、バックライトを使用して96ウェルプレートの底部を検査し、ペレットが存在することを簡単に確認してください。
   23. マルチチャンネルピペットを使用して、最適化された抗体濃度を含む染色マスターミックスに細胞を再懸濁します
       手記：フィルターのないピペットチップを使用して、気泡の発生や染色量の分布のエラーを防ぎます。
   24. アイソタイプ標識細胞とBSLB、蛍光および非蛍光BSLB、および単独で染色された細胞とBSLBが含まれます。すべてのコントロールのウェルあたりのイベント数の合計を尊重します(つまり、5 ×^{10 5} BSLB/ウェルを含むBSLBのみ、および5 × 10⁵ cells/wellを含む細胞コントロールのみを使用して、染色イベントあたりの抗体の相対的な増加を回避します)。
   25. 容量の半分をピペッティングして穏やかに混合し、氷上で30分間インキュベートします。光から保護してください。
   26. 氷冷した2% BSA-PBS、pH 7.4、および500 × gの沈降ステップを使用して細胞とBSLBを2回洗浄し、4°Cで5分間洗浄し、洗浄した共培養物を100μLのPBSに再懸濁し、すぐに取得します。
   27. 固定が必要な場合は、0.5% w/v の PFA を PBS 中で 10 分間固定し、一度洗浄し、取得するまで PBS で保存します。光から保護してください。
   28. 補償の前に、MESF標準を取得し、最も暗い母集団と最も明るい母集団の両方が測定の線形範囲に収まるようにします。
   29. コンペンセーションサンプルを取得し、コンペンセーションを計算し、コンペンセーションマトリックス(リンク)を実験に適用します。
   30. 各定量チャネルについて、合計 2 個×^{10 個}以上の MESF 標準試料を取り込み、保存します。
   31. ハイスループットサンプラーを使用した取得の場合は、装置取得を標準に設定し、サンプル取得を80 μL(または総容量の80%)に設定し、サンプル流量を2.0〜3.0 μL/s、サンプル混合量50 μL(または混合中の気泡形成を避けるために総容量の50%)、サンプル混合を150 μL/sに設定します。 そして3と5の間の井戸ごとの混合。
   32. サンプルごとに最低1×10の⁴つのシングルBSLBを取得します(参照ゲーティング戦略については、図3Bパネル(i)-(vi)を参照してください)。
   33. サイトメーターを洗浄し、洗浄液で5分間、続いて超純水で洗浄してから、装置をシャットダウンします。HTSを使用している場合は、[HTS]タブと[クリーン]オプションの下のオプションに従います。
   34. FCS ファイルをエクスポートします。

3. BSLBへの粒子のシナプス移動の測定

1. 実験 FCS ファイルを開きます。図3B(i)に示すように、細胞とBSLBの側面散乱領域と前方光散乱領域(SSC-AとFSC-A)に基づいて、細胞とBSLBの集団を選択します。
2. 連続取得ウィンドウ内のイベントを選択します(図3B(ii))。
3. セルと BSLB の両方の単一イベントに焦点を当て、シーケンシャル ゲート FSC-W/FSC-H (シングレット-1、図 3B パネル (iii)) および SSC-W/SSC-H (シングレット-2;図3Bパネル(iv))。比例 FSC-A と FSC-H のイベントを選択して、追加のシングレット-3 ゲートを定義します (図 3B、パネル (v))。
4. 各実験サンプルの単一細胞とMESFから、空白および1〜4のMESFフラクションのMFIを抽出します。
5. MESF フラッション 1 から 4 の補正済み MFI (cMFI) 値を生成するには、各フラクションからブランク ビーズ母集団の MFI を減算します。
6. 単一の BSLB およびセルの cMFI を生成します (図 3C パネル (i) を参照)。
7. アイソタイプコントロール抗体で染色したBSLBからのシグナルを使用して、関連するT細胞マーカーに対する抗体で染色したBSLBのMFIを補正します。cMFI を使用して、図 3C パネル (ii) に示す式を使用して、正規化されたシナプス伝達率 (NST%) を計算します。
8. TCR トリガーに応答して特異的に転送される粒子に関心がある場合は、アゴニスティック BSLB の MFI からヌル BSLB からの信号を減算します。この cMFI を使用して、図 3C パネル (ii) に示す式を使用して TCR 駆動の NST% を計算します。
9. T 細胞-BSLB 界面を介して粒子カーゴとして移動した分子の総数を決定することに興味がある場合は、T 細胞-BSLB 共培養と同じ装置設定と取得セッションを使用して MESF ベンチマークビーズを取得します。
10. MESFビーズの集団を解析し、そのcMFIを抽出します。cMFIに対するMESFの回帰分析に最適な線の傾きを計算します。
11. アイソタイプコントロールまたはヌルBSLBをブランクとして使用して計算されたcMFIを使用して、特に刺激的なBSLBに転送されたMESFの数を抽出します。
12. BSLBあたりの計算(平均)MESFを定量抗体のF / P値で割ることにより、BSLBに転送されたマーカーの分子数を計算します。

結果

図1:APC表面上のタンパク質の絶対定量。 (A)扁桃B細胞表面におけるICAM-1の定量的フローサイトメトリー測定の例(Foll.Bc)およびヘルパーT細胞(TFH)です。(I-VII)ヒト口蓋扁桃腺から単離された単一のCXCR5+ BcおよびTFHを分析するためのゲーティング戦略。これは、連続的な取得ウィンドウ内に含まれる 1 つのライブ イベントを識別するためのシーケンシャル ゲーティング戦略を示しています。(iii-iv) 黒色の矢印はダブレットを示します。(viii)(vii)に示されている集団の関連するアイソタイプ(灰色のヒストグラム)および関連するアイソタイプ(灰色のヒストグラムと重なる黒色のヒストグラム)でラベル付けされたFMO対照と比較したIC...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル細胞培養プレートU底蓋付き、組織培養処理済み、非発熱性	共演者®	3799	FCM染色およびBSLBおよび細胞の共培養用。
96ウェル細胞培養プレートV底蓋付き、組織培養処理済み、非発熱性。	共演者®	3894	懸濁液中の細胞またはビーズのFCM染色用。
Alexa Fluor 488 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHSエステル(スクシンイミジルエステル)	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen™	A37573 および A20006
マルチウェル6ウェル 真空ガスプラズマで処理した組織培養	隼	353046	精製されたCD4+およびCD8+ T細胞の培養および増殖用。
ウシ乳由来のカゼイン、プロテインキナーゼ(脱リン酸化後)の基質に適した、精製粉末
Dynabeads ヒト T-アクチベーター CD3/ CD28	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ギブコ	11132D
ダイナマグ-2	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen™	12321Dさん	Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 の除去用
ダイナマグ™-15	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen™	12301Dの	Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 の除去用(15 mL
ウシ胎児血清 Qualified, One Sho	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ギブコ	A3160801	56°Cで30分間の熱不活性化が必要
抗ヒトCD154(CD40L)、クローン24-31	バイオレジェンド	310815と310818	Alexa Fluor 488およびAlexa Fluor 647コンジュゲート
アルメニアハムスターIgG Alexa Fluor 647アイソタイプコントロール、クローンHTK888	バイオレジェンド	400902	Alexa Fluor 647 NHS Ester(スクシンイミジルエステル)のラベルが社内で貼付されています。
BDサイトメーターのセットアップとトラッキングビーズ	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー (BD)	641319	定量FCM前の機器の性能トラック