細菌由来の抗菌化合物の効果を評価するための遅延増殖阻害アッセイ

要約

出典: Moran, J. C. et al., Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition. J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、ある種類の細菌が産生する抗菌化合物が別の競合細菌株にどのように影響するかを調査するために使用される遅延増殖阻害アッセイを紹介しています。

プロトコル

次の方法は、阻害剤産生株を持つ競合他社の株をテストするために適応されています。

>注:このプロトコルには、細菌培養によるエアロゾル生成が含まれます。これは、現地で承認された安全上の考慮事項が実装された封じ込められたスペースでのみ実行できます。レベル2の安全キャビネット内の寒天プレートに培養物を噴霧すると、寒天プレートと周辺環境の汚染が最小限に抑えられます。これにより、噴霧された細菌のエアロゾル吸入から研究者を保護することにもなりますが、研究者が封じ込めレベル2の生物を使用している場合、これは大きな懸念事項です。適切な個人用保護具を着用する必要があります。ペトリ皿の周囲は、使い捨ての吸収組織で覆うのが最適です。スプレー後のUVライトによる除染をお勧めします。

1. 寒天プレートの準備

1. 製造元の指示に従って、脳心電位(BHI)寒天培地を準備します。
2. BHI寒天を121°C、15ポンドフォース/平方インチ(psi)で20分間、またはオートクレーブメーカーの推奨に従ってオートクレーブして滅菌します。
3. 滅菌したBHI寒天の15mlアリコートを滅菌ペトリ皿に注ぎ、固める
   手記：アッセイ内で使用されるすべての寒天プレートが同じ寒天ストックに由来し、各プレートに同じ量の寒天が存在することを確認してください。これにより、利用可能な栄養素のばらつきとプレート間の阻害剤の拡散が制限され、比較が可能になります。

2. 滅菌スープの準備

1. 製造元の指示に従ってBHIブロスを準備します。
2. 10 mlのBHIアリコートを28 mlのガラスユニバーサルボトルに追加します。.
3. BHIブロスを121°C、15psiで20分間オートクレーブ処理するか、オートクレーブメーカーの推奨に従って滅菌します。
   手記：アッセイで使用されるすべてのブロスが、同時にオートクレーブされたブロスの同じバッチに由来することを確認し、結果のばらつきを引き起こす可能性のある栄養素のばらつきを制限します。

3. 滅菌気化器ボトルの準備

1. 気化器のボトルを分解します。
2. 気化器に5%界面活性洗浄剤を噴霧して内部汚染物質を除去し、気化器のボトル、蓋、および気化器を5%界面活性洗浄剤に一晩浸します。
   手記：表面活性洗浄剤を取り扱うときは、手袋と適切な個人用保護具を使用する必要があります。
3. 気化器、蓋、ボトルを滅菌エアフローフードで乾燥させます。
4. ボトルに70%エタノールを入れ、気化器を再度取り付け、エタノールの一部を気化器にスプレーします。
5. 気化器に蓋をし、エタノールを使用まで内部に保管します。
6. 使用直前に、ボトルを滅菌BHIブロスで無菌的にすすぎ、ブロスを気化器に噴霧します。
   手記：これにより、エタノールがセクション6.3でボトルに追加された接種物に影響を与えるのを防ぎます。

4. バクテリアの一晩培養の準備

1. 競合他社と阻害剤の菌株を滅菌BHI寒天プレートにストリークし、37°Cで好気的に約18時間(一晩)インキュベートします><。 手記：このプレートは、4°Cで保存すると、同じ週に複数回の複製に使用できる細菌のストックを生成します。
2. 10 mLの滅菌BHIブロスに、28 mLのユニバーサルボトル内で必要な競合細菌株の1つのコロニーを接種します。
3. ユニバーサルボトルを37°Cで一晩好気的にインキュベートし、オービタルシェーカーで250rpmで振とうします。

5. 阻害剤産生分離株のスポット培養

1. セクション4で説明されているように、一晩の培養を準備します。
2. 接種前に、寒天プレートが完全に乾燥し、蓋に結露が生じていないことを確認してください(例:プレートを37°Cで60分間インキュベートするなど)これにより、接種部位からプレート全体に接種物が広がるのを防ぎます。
3. 一晩培養した25μlを寒天プレートの中央にピペットで移します。ピペットプランジャーを完全に押し下げて、気泡が寒天全体に拡散するのを防ぎます。
4. 培養物の拡散を制限するために、培養物を室温で乾燥させます。寒天プレートを37°Cで一晩好気的にインキュベートします。

6. テスト競合菌株のスプレー接種材料の準備

1. セクション4で説明されているように、一晩の文化を準備します。一晩培養液をBHIブロスで10倍に希釈して、約4 x 10⁶コロニー形成単位(CFU)^ml-1と_OD600の懸濁液0.3 ±0.05.
   を得る 手記：10倍希釈しても、すべての細菌種に対して4 x 10⁶ CFU ^ml-1が得られるわけではありませんので、1 x ^10-1-1 x ^10-6の間でメッキ連続希釈を広げて必要な希釈係数を計算します。
2. 希釈した培養物を滅菌プラスチック香水気化器ボトルに注ぎます.
   手記：総体積は、噴霧される寒天プレートの数に必要な量を超えている必要があります。1皿あたり約250μlが直径9cmのシャーレに適しています。

>7. 遅延成長阻害アッセイ

1. 各気化器ボトルに培養物を噴霧して、寒天に噴霧する前に培養物が噴霧機構にロードされていることを確認します。
2. 寒天から約15 cmの距離から、約250 μlの希釈培養物 (一般的な50 ml気化器を3回スプレー) を寒天表面全体に噴霧します。寒天プレートを37°Cで一晩好気的にインキュベートします。同じスプレー数の他のプレートについても繰り返します。

>8. 遅延成長阻害アッセイ結果の解釈

1. 噴霧された競合菌株(図1A-C、「X」から「X」)の成長阻害ゾーンをミリメートル単位で測定し、阻害剤-生産者(図1A-C、「Y」から「Y」)の中心スポットの直径を差し引きます。
   注:図1Eは、このデータがどのように表示されるかを示しています
2. 抑制ゾーンの明瞭度スコアを記録します。
   手記：これは、観察された阻害の程度を示します。例は図1A-Dに示されており、代表結果セクションに標準化に使用できる株が提案されています。明瞭度スコアリングには、次のスケールを使用できます:明瞭度スコア0は、競合他社の成長を完全に阻害するゾーンを表します。スコア1は、成長がほぼ完全に阻害されるゾーンを表し、クリアリングゾーンには個々のコロニーのみが存在する。スコア 2 は、成長が減少している可視ゾーンを表し、このゾーン内の成長はコンフルエントまたはコンフルエントに近いですが、密度は >50% 減少します。スコア 3 は、成長の減少が最小限であること、成長がコンフルエントで 50% 未満減少していること、ゾーンがまだ見えて測定可能であることを示しています。スコア4は、成長の目に見える阻害がないことを示します。スコア5は、試験阻害剤産生株の近接性において、競合菌株の増殖が増加したことを示している。例については、図 1 を参照してください。これらのスコアは、実験者の主観的なものです。

結果

図1:遅延増殖阻害アッセイから得られる定性的および定量的な結果の範囲。成長阻害の結果は、(A)完全阻害(スコア0)、(B)部分阻害(スコア1)、(C)部分阻害(スコア2)から(D)阻害なし(スコア4)までの範囲です。標識は、阻害剤株の増殖エッジ(Y)と阻害ゾーンの最も外側のエッジ(X)を示します。抑制のゾーンのサイズは、A、B、CおよびDで撮影されたプレートの測定値を示す(E)に示すように、0mmから10mmを超える範囲です。結果は、最近のブドウ球菌分離株(A、C)または一般的な実験室ブドウ球菌分離株S.表皮T...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
脳心臓注入ブロス	ラボM	lab049	豊富な汎用メディア
寒天	メルクミリポア	101614
ペトリ皿	ザルシュテット	82.1473.001
プラスチック製香水気化器	不明	-	高さ10cm、直径3.5cmの蓋付き透明プラスチックスプレーボトル、スーパーマーケットの旅行コーナーから購入
ユニバーサルボトル		生産が終了し、代替のSLSがBOT5006	28mlのガラス製円筒形ボトル(直径約280mm、高さ850mm)、平底、プラスチックスクリューキャップ付き
デコン90	デコン		界面活性洗浄剤

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