感染した初代マクロファージにおける細胞質および液胞性サルモネラ菌の定量化アッセイ

要約

出典:Meunier, E., et al. Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、骨髄由来マクロファージ内の細胞質および液胞性サルモネラチフス菌を差動透過化を使用して定量するアッセイを示しています。マクロファージは、蛍光タンパク質を発現するサルモネラ菌に感染しており、サルモネラ菌含有液胞またはSCVと呼ばれる特殊な液胞構造内に取り込まれます。細菌の一部はSCVから逃れてサイトゾルに入ります。マクロファージのコレステロールが豊富な原形質膜は、ジギトニンを使用して透過処理され、SCVはそのまま残ります。細胞質細菌を蛍光標識抗体で標識すると、液胞細菌と細胞質細菌の割合が蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して定量されます。

プロトコル

1. mCherry発現サルモネラ菌を用いたジジトニンアッセイ(FACS法による解析)

1. バクテリアの準備
   注:このアッセイでは、プラスミド(rpsMプロモーターの下でmCherryをコードするpFPV)からmCherryを発現するサルモネラ野生型SL1344(ストレプトマイシン耐性)が使用されます。細菌性食作用および増殖は、mCherryの構成的発現によって変化しなかった(データは示さず)。
   1. 感染の1日前に、ストレプトマイシン(90μg/ml)とアンピシリン(100μg/ml、mCherry発現ベクター)を添加した3mlのLB培地に株を37°C O / Nのシェーカーで接種します。
2. 感染のための細胞のめっき。
   1. 1 mLの一次マクロファージ培地(10% Fetal Calf Serum(FCS、熱不活化、56°C、30分)、1% 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1% L-グルタミンおよび10% L929上清(マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)産生L929細胞からの馴化培地)中の密度1.25 x 10 5細胞/ウェルの24ウェルプレートに野生型BMDMを播種します。表1に従ったシードウェルは、個々の条件を考慮しています。コントロールとして使用するウェルにカバースリップを追加します(表1)。
   2. 細胞をインキュベーター内で37°C、5%CO₂で一晩インキュベートします。
3. 感染のために細菌を準備します。
   1. 翌日、培養物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:10に希釈し、PBSのみのコントロールに対してOD₆₀₀を測定することにより、一晩培養中のサルモネラ菌の濃度を決定します。これにより、OD₆₀₀は分光光度計の線形範囲で測定されます。
   2. mlあたりのサルモネラ菌の濃度を計算します。OD₆₀₀ が 1 の場合、1 x 10⁹ のバクテリアに相当します。
   3. マクロファージ培地で細菌を希釈して、サルモネラ菌濃度が1.25 x 10⁶細胞/mlになるようにします。
4. サルモネラ菌による細胞の感染。
   1. BMDMから培地を取り出し、1 mLのマクロファージ培地を未感染のコントロールウェル(B1-B3、C1-C3)に加えます。1 mLのサルモネラ懸濁液をウェルA1 - A5に加えて、細胞あたり10個の細菌の感染の多様性(m.o.i.)に到達します。
   2. プレートを300 x g、37°Cで15分間遠心分離し、感染を同期させます。プレートを37°Cおよび5%CO₂のインキュベーターに移します。
5. ゲンタマイシンによる細胞外サルモネラ菌の死滅。
   1. 感染後1時間後に、プレートをインキュベーターから取り出し、0.1 mg / mlのゲンタマイシンを含む0.1 mlのマクロファージ培地を追加して細胞外細菌を殺します。.ゲンタマイシンをすべてのウェルに加え、感染していないコントロールにも追加して、すべての細胞が同じように処理されるようにします。プレートを37°Cおよび5%CO₂のインキュベーターに移します。
6. 細胞を洗浄します。
   1. 感染後2時間後に、プレートをインキュベーターから取り出し、すべてのウェルを1 mlのプレーンDMEM(37°Cに予熱)で2回洗浄し、10 μg/mlのゲンタマイシンを含むマクロファージ培地(37°Cに予熱)と交換して、残りの細胞外細菌の増殖を防ぎます。プレートを37°Cおよび5%CO₂のインキュベーターに移します。
7. 界面活性剤と抗体を用いた新鮮なバッファーの調製。
   1. 分析の所望の時点の直前に、KHMバッファー(110 mM酢酸カリウム、20 mM HEPES、2 mM MgCl₂、pH 7.3)に1 mg / mlのジギトニンの新鮮なストック溶液を調製します。ストックをろ過し、KHMバッファーで50μg/mlのジギトニンの使用濃度に希釈します。さらに、KHM Buffer に 0.1% サポニン、フルオレセイン イソチオシアネート (CSA-1-FITC) に結合した抗サルモネラ抗体 (CSA-1-FITC) を 1/500、抗カルネキシンを 1/100 に、または抗タンパク質ジスルフィド イソメラーゼ (抗 PDI) を 1/100 に 3% ウシ血清アルブミン (BSA) を添加した溶液を調製します。
8. 細胞の透過化。
   1. インキュベーターからプレートを取り出し、0.5 mLのKHM Buffer(37°Cに予熱)でウェルを3回洗浄します。KHMバッファーを取り外し、0.25 mlのプレーンKHMバッファーをウェルA4およびB1 / C1に、ジギトニンを含むKHMバッファーをウェルA1-A3およびB2 / C2に、またはサポニンを含むKHMバッファーをウェルA5およびB3 / C3に追加します(表1による)。室温で正確に1分間インキュベートし、直ちにすべてのウェルを0.5 mLのKHM Buffer(37°Cに予熱)で3回洗浄します。
9. 一次抗体染色。
   1. KHMバッファーを取り出し、一次抗体溶液(ヤギ抗サルモネラ-FITC、250 μl/ウェル、0.1 μg/ml)を適切なウェルに加えます(図1、表1)。プレートをインキュベーター内で37°Cおよび5%CO₂の15分間インキュベートします。
   2. 細胞を1mLのPBSで1回洗浄します。
10. 感染細胞(ウェルA1 - A5):FACS分析
    1. 細胞をPBSで3回洗浄し、0.1%トリトンを含む氷冷PBS0.5 mLを加えます。細胞ストレーナーキャップ付きの5mL FACSチューブに移し、細胞凝集体を分解します。サンプルを氷の上に置きます。
    2. FACSのサンプルを分析します。完全に透過化されたコントロールを使用して、前方散乱光と側方散乱光(FSC/SSC)に基づいて全細菌のゲートを最初に設定し、mCherry信号(610 nm±20 nmフィルター
    )を設定します。
    3. 次に、完全透過処理されたコントロールと透過処理されていないコントロールを使用して、全細菌集団のFITCシグナルを解析し、細胞質細菌(FITC+、mCherry+)および液胞細菌(FITC-、mCherry+)のゲートを設定します(図2)。
    4. ゲートを設定したら、サンプルを分析し、FlowJoソフトウェアを使用して、メーカーのプロトコルに従って細胞質細菌と液胞菌の割合を決定します。

>表1:骨髄由来マクロファージ(BMDM)の24ウェルフォーマットのプレーティングスキームで、その後のサルモネラ菌の感染、透過化、および染色を行います。

		透過化		染色
	ガラスカバースリップ	サルモネラ	ジジトニン	サポニン	抗サルモネラ菌	抗カルネキシン	反PDI
A1(サンプル)	-/+*	+	+		+
A2(サンプル)	-/+*	+	+		+
A3(サンプル)	-/+*	+	+		+
A4(透過制御なし)	-/+*	+			+
A5(完全透過制御)	-/+*	+		+	+
B1(カルネキシン染色)	+					+
B2(カルネキシン染色)	+		+			+
B3(カルネキシン染色)	+			+		+
C1 (PDI染色済み)	+						+
C2 (PDI染色済み)	+		+				+
C3 (PDI染色済み)	+			+			+

結果

図 1.プロトコル 1 の概略図。mCherry陽性サルモネラ菌を含む感染細胞は、無傷の液胞またはサイトゾルのいずれかで、ジギトニンで差次的に透過処理されます。細胞質サルモネラ菌は、FITCに結合した抗サルモネラ菌で染色されます。細胞をTriton X-100で洗浄および溶解し、FACS解析を行います。ネガティブコントロール細胞は透過処理されませんが、ポジティブコントロール細胞は抗体染色前に完全に透過処理されます。

図 2.mCherry+野生型またはΔsifA<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ジジトニン	シグマ	D5628	50μg/mL
PFAの	エムピーバイオ	219998380
ヘープス	ライフテクノロジー	15630
酢酸カリウム	シグマ	791733
MgCl2	シグマ	M8266
BSAの	シグマ	A2153の
抗サルモネラ菌 CSA-1-FITC	KPLの	01-91-99-MG	1/500
抗サルモネラ菌CSA-1	KPLの	02-91-99-MG	1/500
抗カルネキシン	エンツォライフサイエンス	スパ-860D	1/100
反PDI	エンツォライフサイエンス	スパ-890	1/100
サポニン	シグマ	47036
Vectashield封入剤	ベクターラボ	H-1200
抗ウサギ抗体-488	分子プローブ	A-11070	1/500
ゲンタマイシン	ライフテクノロジー	15710-49	100ug/mLおよび10ug/mL
トリトンX-100	プロメガ	H5141-J
PBSの	ギブコ	20012年019
DMEM	シグマ	D6429
NEAAの	アミメド	5-13K00-H
FACSフォルテッサ	BDテクノロジー		検出 mCherry 610 nm
FACSフォルテッサ	BDテクノロジー		検出用FITC 530 nm

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