前処理されたヒト血小板のコラーゲン誘発凝集をモニターするための比濁分析

要約

出典:Molica, F. et al., ヒト洗浄血小板に対するタービジメトリー:コラーゲン誘発凝集に対するパネキシン1阻害剤ブリリアントブルーFCFの効果。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、前処理され、洗浄されたヒト血小板におけるコラーゲン誘発血小板凝集を評価するための比濁分析を示しています。対照ウェルはコラーゲン誘導性凝集を示しますが、高濃度の阻害剤はパネキシン-1チャネルをブロックし、それによってコラーゲン誘発性血小板凝集を阻害します。これは、変化しない濁度から明らかです。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. ヒト採血と洗浄血小板単離のための緩衝液調製

1. 1.4gのクエン酸一水和物(C₆H₈O₇•H₂O、66.6 mM)、2.5 gのクエン酸三ナトリウム二水和物(Na₃C₆H₅O₇•2 H₂O、85 mM)および2gの無水D(+)-グルコースを溶解することにより、酸性-クエン酸-デキストロース(ACD)の100 mL水溶液を調製します。溶液のpHは約4.5です。
2. Tyrodeのバッファー用のストック溶液を次のように調製します
   1. 80 gの塩化ナトリウム(NaCl)、2 gの塩化カリウム(KCl)、10 gの重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、および0.58 gのリン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH₂PO₄ * H₂O)を500 mLの蒸留H₂Oに溶解して、原液1を調製します。それぞれの最終濃度は、2.73 M、53.6 mM、238 mM、および8.4 mMです。溶液を4°Cに保ちます。
   2. 10.15 gの二塩化マグネシウム六水和物(MgCl₂ * 6 H₂O)(100 mM)を500 mLの蒸留水(H₂O)に溶解して、原液2を調製します。溶液を4°Cに保ちます。
   3. 10.95 g(100 mM)塩化カルシウム六水和物CaCl₂*6 H₂Oを500 mLの蒸留H₂Oに溶解して、原液3を調製します。
3. Tyrodeの緩衝液を調製するには、最終容量50 mLの原液1 2.5 mLを蒸留H₂Oで希釈します。これは、136.5 mM NaCl、2.68 mM KCl、11.9 mM NaHCO₃、および0.42 mM NaH₂PO₄*H₂Oの最終濃度に相当します。 pHを7.35に調整し、0.22μmフィルターでろ過して滅菌します。
4. 5 mLの原液1、1 mLの原液2、2 mLの原液3、0.5 mLの1M HEPES、1.8 mLの200 g/Lヒト血清アルブミン、および0.1 gの無水D(+)-グルコースを最終容量100 mLの蒸留H₂Oで希釈することにより、チロードアルブミン0.35%緩衝液(TAバッファー)を調製します。
   1. 1N塩酸(HCl)でpHを7.35に調整し、蒸留_H2O(総容量の10%)を添加して浸透圧を295mOsm / Lに設定します。この溶液中の最終濃度は、124 mM NaCl、2.44 mM KCl、10.82 mM NaHCO₃、0.38 mM NaH₂PO₄*H₂O、0.91 mM MgCl₂*6 H₂O、1.82 mM CaCl₂*6 H₂Oです。

2. 血液収集

1. 19 Gの針を使用し、止血帯なしまたは低止血帯を使用して、肘前静脈から45〜50 mLの静脈血をACD抗凝固剤(6容量の血液に対して1容量のACD)を含む50 mLのチューブに収集します。.トロンビンと組織因子の存在を避けるために、最初の1〜2 mLの血液を廃棄します。.
   1. 採取後、チューブを静かに反転させて血液をACDと混合します。サンプルを37°Cで10分間インキュベー
   トします。

>3. ヒト洗浄血小板の調製

1. 遠心分離機を37°Cに予熱します。以下のすべての遠心分離ステップは、この温度で実行されます。
2. 採取した血液を 15 mL チューブ (チューブあたり 5 mL) に送り込み、250 x g で 13 分間遠心分離して、多血小板血漿 PRP.
   を得ます。 手記：この遠心分離ステップにより、サンプル中に3つの層が生成されます:1)血漿、血小板、および少量の白血球で構成される上層。2)中間層とは、白血球が豊富な部分である。3)最下層は、基本的に赤血球で構成されています。
3. 赤血球と白血球の汚染を最大限に防ぐために、上層を新しい15 mLチューブに慎重にピペットで移してPRPを回収し、37°Cで10分間インキュベートします。
4. PRPを2,200 x gで12分間遠心分離します(5 mL PRPの場合).
   手記：この遠心分離ステップは、ローブレーキまたはブレーキなしで実行する必要があります。
5. 上清(血小板が少ない血漿)を取り除き、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、2 μL/mL のヘパリン (5,000 U/mL) と 2.5 μL/mL の 25 μM プロスタサイクリン (PGI₂) を含む 10 mL の TA バッファーでペレットを慎重に再懸濁します。37°Cで10分間インキュベートします。
6. 2.5 μL/mL の 25 μM プロスタサイクリン-I2 (PGI₂) を添加し、1,900 x g で 8 分間遠心分離します (ローブレーキありまたはブレーキなし)。
7. 上清を取り除き、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、2.5 μL/mLの25 μM PGI₂を含む5 mLのTAバッファーでペレットを再懸濁します。37°Cで10分間インキュベートします。
8. インキュベーション期間中、150 μLの血小板懸濁液を1.5 mLチューブにピペットで移し、自動セルカウンター(直流抵抗の変化を測定することで血球のサイズを検出する)を使用して血小板をカウントします。
9. 10分間のインキュベーション後、2.5 μL/mLの25 μM PGI₂を血小板懸濁液に加え、直ちに1,900 x gで8分間遠心分離します。
10. 上清を取り除き、ペレットを250,000血小板/μLの濃度に再懸濁し、32μL/mLのアピラーゼを0.01 U/mL(最終濃度0.32 U/mL)で32 μL/mLのアピラーゼを含む適切な量のTAバッファー(つまり、細胞数が500,000 / μLの場合は、10 mLのTAバッファーに再懸濁します><)。. 手記：高濃度のアピラーゼは、アゴニストの非存在下でアデノシン三リン酸(ATP)の自然分泌によって誘発されるP2X1受容体であるP2X受容体であるP2X受容体の脱感作を回避するために使用されます。コラーゲン誘導応答は、活性化血小板から放出されるATPによるP2X1の高速パラクリン/オートクリン活性化によって誘導されるため、これは重要です。血小板シグナル伝達経路がP2X1機能の保存を決定的に必要としない場合は、0.02 U/mLアピラーゼを使用してください。いくつかの研究では、0.02 U/mLのアピラーゼがアデノシン二リン酸ADP受容体P2Yプリン受容体1、およびP2Y1の脱感作を回避し、P2X1応答が無視できることが示されました。
11. 凝集測定を行う前に、細胞懸濁液を37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。調製物は5〜8時間安定です。

4. アグリゴメトリ

1. フィブリノーゲン(56 mg/mL)をTyrodeの緩衝液に調製します。
2. 260 μLの血小板懸濁液を、10 μLのフィブリノーゲン(56 mg/mL)と磁気攪拌ロッドを含むガラスキュベット(図1A、左キュベット)にピペットで移し、懸濁液を凝集計(図1Bおよび1C)内のインキュベーションウェルで37°Cで2〜3分間インキュベートします。
3. Panx1阻害剤Brilliant Blue FCFとプレインキュベートするには、2.8 mMまたは28 mMのストック溶液(最終濃度100 μMおよび1 mM)10 μLを37°Cで7分間加えます。
4. 10 μL フィブリノーゲン(56 mg/mL)、10 μL Brilliant Blue FCF(2.8 mM または 28 mM)、および血小板を含まない TA バッファーを含むキュベットの光学密度(OD)を測定することにより、凝集計を仮定 100% 凝集値にキャリブレーションします。
   1. キュベットを自動攪拌下のアグリゲーションウェルに置き、アグリゴメーターにリンクされたコンピューターのキーボードの対応するボタンを押します(つまり、アグリゲーションウェル1を使用する場合はF1を押します)
      手記：以下で説明する実験には、ブリリアントブルーFCFが含まれています。キャリブレーションに使用する化合物は、実験条件に合わせて調整する必要があります。
5. 自動攪拌下での実験に使用されるのと同じ血小板サンプルを使用して、アグリゴメーターを仮定の0%凝集値に較正します。
   1. キュベットをアグリゲーションウェルに置き、アグリゴメーターにリンクされたコンピューターのキーボードの対応するボタンを押します。約20〜30秒待ってから続行します。この遅延は、アゴニストを追加する前に凝集が起こらないようにするのに役立ちます。
      手記：血小板数の違いが測定されたODに影響を与える可能性があるため、個々の測定ごとに0%キャリブレーションステップを繰り返す必要があります。
6. 15 μg/mL コラーゲン (最終 1 μg/mL) または 1.125 mM アラキドン酸 (最終 75 μM )などの目的のアゴニスト 20 μL をキュベットに加えます。アグリゴメーターにリンクされたコンピューターのキーボードの対応するボタンを押して、連続自動攪拌下で記録をすぐに開始します.
   手記：アゴニストの添加により、血小板の活性化が誘導されます。血小板凝集体は、実験終了時のガラスキュベットで明確に区別できます(図1A、右キュベット)。
7. 録音は6分後に自動的に停止します。この時点で、コンピューターの保存アイコンをクリックしてデータを保存します。
   手記：集計速度の計算はコンピューターによって実行され、集計プロセスの最終結果はパーセンテージで表されます。

結果

図1:アグリゴメトリ (A)アグリゴメトリーに用いるガラスキュベット(攪拌磁石入り)の代表画像。左のキュベットは休止中の血小板を示し、右のキュベットはコラーゲンによる活性化後の血小板凝集体を示しています。(B)比濁測定用の8ウェルアグリゴメーターの代表的な画像。ガラスキュベット中に存在する血小板懸濁液を37°Cでインキュベートするために使用したウェル(アスタリスク)と、測定に使用したウェル(白矢印)をCで示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クエン酸一水和物(C6H8O7 * H2O)	ロス	〒5949-29-1	目の損傷/刺激の危険性
クエン酸三ナトリウム二水和物(Na3C6H5O7 * 2H2O)	シグマ・アルドリッチ	S1804	-
D(+)-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8270	-
塩化ナトリウム(NaCl)	シグマ・アルドリッチ	S9888	-
塩化カリウム(KCl)	シグマ・アルドリッチ	P9541	-
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	シグマ・アルドリッチ	S6014	-
二水素リン酸ナトリウム一水和物(NaH2PO4 * H2O)	シグマ・アルドリッチ	S9638	-
塩化マグネシウム六水和物(MgCl2 * 6H2O)	シグマ・アルドリッチ	M9272	-
塩化カルシウム六水和物(CaCl2 * 6H2O)	シグマ・アルドリッチ	442909	目の損傷/刺激の危険性
N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(Hepes)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630	-
ヒト血清アルブミン	CSLベーリング	00257/374	-
塩酸	シグマ・アルドリッチ	320331	呼吸器系に腐食性および刺激性があります。皮膚や目の深刻な損傷を引き起こす可能性があります。
エッペンドルフ5810 R	フィッシャーサイエンティフィック	-	-
ヘパリン	ドロスファームAG / SA	20810
プロスタサイクリンI2(PGI2)	ケイマン	18220	-
ジャガイモからのアピラーゼ	シグマ・アルドリッチ	A6535 (英語	-
フィブリノーゲン(ヘモコンプリートタン)	CSLベーリング	HS 73466011	-
血栓凝集計 SD-Medical	SD-イノベーション	TA8Vの	-
ブリリアントブルーFCF(エリオグラウシン二ナトリウム塩)	シグマ・アルドリッチ	80717	水生生物に有害で、長期的な影響があります(周囲への放出を避けてください)
コラーゲン	ホルム、ナイコメッド		-
アラキドン酸	バイオ/データコーポレーション	C/Nの101297	-
セルカウンター Sysmex KX-21N	シスメックス デジタナ	-	-
ヘープス	ギブコ	15630から056	-
ガラスキュベット	SD-イノベーション	THCV1000	-
マグネチックスターラー	SD-イノベーション	100タイタ	-

の 型 シリーズ )