>注:セクション1および2に記載されているすべてのステップは、層流キャビネット内の無菌条件下で実行されます。
1. U87のメンテナンス。CD4.hCXCR4細胞
- T75培養フラスコの細胞を37°C、加湿インキュベーターで5%CO2で増殖させます
手記：このプロトコルで使用されるインビトロ細胞株は、分化クラスター4(CD4)およびヒトCXCケモカイン受容体4(CXCR4)を安定して発現するU87神経膠芽腫細胞株であり、以前に説明されています。CD4およびCXCR4の細胞表面発現はフローサイトメトリーによって連続的にモニタリングされ、発現レベルは経時的に一定に保たれます(~100%CD4+および~100%CXCR4+細胞)。使用済み細胞株の作製および受容体発現レベルを調査するためのフローサイトメトリー手順の詳細な説明は、このプロトコルの範囲外です。
- 細胞を80〜85%のコンフルエントで継代培養します。細胞培養前に、すべての試薬を室温(RT)に到達させます。
- 馴染ませた培地を細胞から取り出し、細胞単層を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄します。
- 0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(トリプシン-EDTA)を3mL加え、細胞単層に均一に分配します。次に、余分なトリプシン-EDTAを除去し、細胞が剥離し始めるまで37°Cで最大5分間インキュベートします。
- 10 mLの新鮮な完全増殖培地(ダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)+ 10%ウシ胎児血清(FBS)+ 0.01 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)+適切な選択剤)を加えます。細胞を静かにピペッティングして、細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を滅菌済みの50mLチューブに移します。
- 選択した方法を使用して、生存細胞の数をカウントします。U87膠芽腫細胞の場合、生存率は一般に~100%に達します
手記：セル番号はいくつかの方法で決定できます。私たちは、トリパンブルー染色に基づく自動細胞解析システム(材料表を参照)を標準的な取り扱い手順に従って日常的に使用していますが、他の方法も同様に機能するはずです。
- T75培養フラスコで2 x 106または3 x 106(生細胞)を最終容量の25 mL新鮮増殖培地に添加し、37°Cおよび5%二酸化炭素(CO2)でインキュベートします
手記：3 x 106細胞を使用すると、細胞は2日後に80〜90%の密度に達します。2 x 106細胞を使用すると、3日後に同じコンフルエントに到達します。細胞の増殖速度は、他の細胞株を使用する場合、まず経験的に決定する必要があります。
2. Ca2+ Mobilization Assayのための細胞の播種
- 細胞継代の日(0日目)に、透明な底部を持つ黒壁のポリスチレン96ウェルプレート(材料の表を参照)に0.1%ゼラチン溶液をコーティングして、細胞の接着を促進します。
手記：市販のプレコートプレート(材料の表を参照)を使用する場合は、96ウェルプレートのゼラチンによるコーティングを省略できます。プロトコールを続行する前に、調査中の各細胞株について、手動コーティングの代わりにプレコートプレートの使用を評価することをお勧めします。
- 100mLのPBSに1gのゼラチンを加えてゼラチン溶液を調製し、1%溶液を得ます。さらに使用する前に、PBSで10倍に希釈してください。ゼラチンの溶解性を向上させるには、溶液を37°Cに加熱します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートのウェルあたり100 μLの0.1%ゼラチン溶液を添加します。RTで2時間インキュベートします。
- その間に、コーティングされた96ウェルプレートに播種するための細胞を準備します。
- 細胞を培養フラスコから切り離し、新鮮な増殖培地に再懸濁し、トリパンブルー染色法を使用して細胞をカウントします。
- 50 mLチューブ内で細胞を400 x g、室温で5分間スピンダウンします。
- 細胞を新鮮な増殖培地(DMEM + 10% FBS + 1% HEPES、抗生物質なし)に再懸濁して、0.1 x 106(生細胞/mL)の細胞密度を得ます。
- 底が透明な黒壁のプレートからゼラチン溶液を取り出し、プレートを裏返し、ティッシュで乾燥させます。200 μL/well PBSを加えて余分なゼラチンを取り除き、プレートを再び裏返します。
- ゼラチンでコーティングされた96ウェルプレート(以下、このプレートをさらに「測定プレート」と呼ぶ)に、ウェルあたり200μLの細胞懸濁液(0.2 x 105細胞に相当)を分注します。
- プレートを37°Cおよび5%の二酸化炭素(CO2)で一晩インキュベートします。
3. Fluorescent Ca2+ -sensitive Dyeによる細胞のローディング
- 1日目に、蛍光Ca2+結合色素fluo-2アセトキシメチル(fluo-2 AM)を播種細胞にロードすることから始めて、実際のCa2+動員アッセイを実行します。
- 200 mLのハンクス平衡塩溶液(HBSS、10倍、フェノールレッドなし、重曹なし)に40 mLのHEPES(1 M)を加えて、アッセイバッファーを調製します。超純水を加えて最終容量2 Lにし、ウシ血清アルブミン(BSA)を4 g加えます。磁気攪拌によりBSAを溶解します。pHを7.4(水酸化ナトリウム、NaOHを含む)に調整し、溶液をろ過します。
手記：以下のすべてのステップでは、「アッセイバッファー」と呼ばれる同じバッファーが使用されます。
- 蛍光Ca2+感受性色素fluo-2 AMのストック溶液(ジメチルスルホキシド(DMSO)中の4 mM)を調製します。光に過度にさらさないでください。1 mg fluo-2 AM(分子量:1,061 g/mol)を235.6 μL DMSOに溶解します。
- fluo-2 AMの作業溶液を準備します。96ウェルアッセイプレート1枚につき、12.5 μLのfluo-2 AMストック溶液(4 mM)と12.5 μLの非イオン性界面活性剤ポリオール(プルロン酸f-127など)溶液を混合します(DMSO中の重量/容量の20%、材料の表を参照)。この混合物22 μLを15 mLチューブ内の11 mLアッセイバッファーに加えます。fluo-2 AMの最終濃度は4μMです
手記：ノニオン性界面活性剤は、fluo-2 AMの水溶性を改善し、その結果、細胞負荷を高めるための分散剤として使用されます。界面活性剤をDMSOに可溶化するには、サンプルを37°Cで加熱し、定期的に混合して均質な溶液を得ます。
- 96ウェル測定プレートで以前に播種した細胞から増殖培地を取り出し、プレートを裏返し、ペーパータオルで乾燥させます。
- マルチチャンネルピペットを使用してウェルあたり100 μLのローディング色素溶液を添加し、暗闇でRTで45分間インキュベー
トします。
4. ケモカイン配位子CXCケモカイン配位子12(CXCL12)または調査中の化合物を含む96ウェルポリプロピレンプレートの調製
- 丸底ポリプロピレン(PP)96ウェルプレートを入手します(材料の表を参照)。
- CXCL12のストック溶液(1 mg / mL)と調査中の化合物のストック溶液をRTで平衡化させます
手記：CXCL12の原液は、0.01%Tween20を添加した超純水で調製し、シングルユースアリコートとして-20°Cで保存します。
- アッセイバッファー(250 ng/mL、31.25 nMに相当)にCXCL12の5倍濃縮溶液を調製し、各化合物の5倍濃縮希釈液(アッセイバッファー内)を調製します。
- ストック溶液を、あらかじめ定義されたプレートレイアウトに従って適切な96ウェルプレートに分注します。CXCL12 を含むプレート (「ケモカインプレート」) に 75 μL/ウェルを分注し、化合物を含むプレート (「コンパウンドプレート」) に 50 μL/ウェルを分注します。
手記：化合物とCXCL12は、測定プレートに分注すると、最終的に5倍に希釈されます。また、アッセイバッファーのみを含むネガティブコントロールウェルをコンパウンドプレートとケモカインプレートの両方に含めることも重要です。また、ポジティブコントロールウェルを含める必要があります(すなわち、ケモカインプレートにCXCL12を含むウェルですが、コンパウンドプレートの対応するウェルにアッセイバッファーを含むウェル )。
>5. 蛍光マイクロプレートリーダーでのプロトコール設定
>注:このプロトコールで使用される蛍光マイクロプレートリーダーは、材料の表で参照されています。
- 最初に蛍光プレートリーダーのクーラーユニットの電源を入れてから、蛍光リーダー自体のスイッチを入れます。数分間開始し、システムのソフトウェアを開きます。
- 以下のステップを含むドラッグ&ドロップメニューを使用して、アッセイのプロトコールを作成します。
- 「Settings」ボックスで、励起波長:470-495 nM、発光波長:515-575 nMの「Read_Mode」を選択します
手記：選択した波長は、Ca2+感受性色素fluo2での使用に適しています。
- コンパウンドプレート内のコンパウンドを自動的に混合するための「TFと混合」(トランスファー流体)ボックスを含め、デバイスのソース2位置に配置します(ステップ6.4を参照)。各ウェルで15μLの溶液を選択し、自動的に吸引して3回混合します。ピペットチップの高さを液面から20μL下に調整します。吸引と分注の速度を50 μL/sに設定します。
手記：ピペットチップの高さは、ピペットチップの下に残っている容量を指します。たとえば、コンパウンドプレートのウェルに50μLが含まれている場合、30μLの高さは液体表面から20μL下に相当します。混合する化合物溶液の量、混合速度、混合中のピペットチップの位置、混合サイクルの数はすべてソフトウェアを使用して調整できます。
- 「Transfer Fluid」ボックスで、コンパウンドプレートの各ウェルの20 μLを測定プレートに移すことを定義します。ピペットチップを液面から20 μL下、つまり、化合物の吸引中は30 μLの高さ、測定プレートでの分注中は60 μLの高さに配置します。吸引速度を50 μL/s、分注速度を25 μL/sに設定します。
手記：コンパウンドプレートにはウェルあたり50 μLの溶液が含まれているため(ステップ4.1.3を参照)、30 μLの高さは液体表面から20 μL下の位置に相当します。測定プレートには、ウェルあたり80μLのアッセイバッファーが含まれているため(ステップ6.3を参照)、60μLの高さはチップの同様の位置に対応します。
- 「TFで読み取り」ボタンを選択します。最初のインターバルでは、読み取りインターバル時間を 1 秒にして 60 リード (蛍光測定) を選択します。コンパウンドを測定プレートに分注する前に10回の読み取りを記録し、その後に50回の読み取りを記録することを定義します。読み取り間隔を 30 秒、読み取り回数を 18 回に設定して、2 番目の間隔を定義します。
手記：このステップでは、蛍光は合計で~10分間、(定義された時間間隔で)速度論的に測定されます。
- 「Wash Tips」ボタンをプロトコールに3回含めます。各洗浄ステップで、流体A(超純水)または流体B(70%エタノール)の流体タイプ、洗浄サイクル数(1)、ポンプ速度(高速)、および各洗浄ステップ中のストローク数(5)を選択します
手記：第1および最後の洗浄ステップでは流体Aが使用され、第2の洗浄ステップでは流体Bが使用される。
- 「Pipettorの一時停止」機能を含めます。ピペッターを300 s.
一時停止するように設定します
手記：このステップをプロトコルに含めることにより、蛍光プレートリーダーデバイスに組み込まれているピペッターヘッドは、プロトコルを続行する前に5分間一時停止します。
- CXCL12溶液をケモカインプレートに自動的に混合できるように、「Mix with TF」ボックスを含めます。ケモカインプレートは、デバイスのソース3の位置に配置されます(ステップ6.4を参照)。各ウェルで15μLの溶液を選択し、自動的に吸引して3回混合します。吸引および混合中は、ピペットチップを液面から20μL下に配置します。吸引と分注の速度は50μL/sに設定されています。
手記：ステップ 5.2.2 と同様に、これらのパラメーターは調整できます。
- 後続の「Transfer Fluid」ボックスで、ケモカインプレートの各ウェルから25 μLを測定プレートに移すことを指定します。チップを液面から20 μL下、つまり、75 μL/ウェルを含むケモカインプレートからの吸引中は55 μLの高さ(ステップ4.1.3を参照)、測定プレートでの分注中は80 μLの高さにチップを配置します。吸引速度を50 μL/s、分注速度を25 μL/sに設定します。
- 「TFで読み取り」ボタンを含めます。最初のインターバルでは、リード・インターバル時間を 1 秒にして 145 リードを選択します。CXCL12を測定プレートに分注する前に5回の読み取りを記録し、その後に140回の読み取りを記録することを定義します。読み取り間隔時間を 6 秒にして 2 番目の間隔を定義し、20 の読み取りを選択します。
手記：まとめると、プロトコル全体を通じて243の読み取り(蛍光測定)が記録されます:ステップ5.2.4で78、ステップ5.2.9で165 。
- ステップ5.2.5と同様に、プロトコルに「Wash tips」ボタンを3回含めます
手記：このステップをプロトコルの最後に含めることで、チップを交換することなく、チップを再利用して別のアッセイを行うことができます。
- 「Set stage temperature」ボタンをクリックし、37°Cを選択して、デバイスの温度を37°Cに設定します。
6. 蛍光アッセイの実行
- 測定プレートをローディングバッファーと45分間インキュベートした後(ステップ3.1.5を参照)、プレートを裏返してバッファーを取り出し、組織上で乾燥させます。
- 150 μL/ウェルのアッセイバッファーを加えて播種した細胞を洗浄し、2分間インキュベートします。
- プレートを裏返して、バッファーを再度取り外します。80 μL/ウェルのアッセイバッファーをマルチチャンネルピペットで加えます。
- すべてのプレートを適切な位置(複合プレートはソース2の位置、ケモカインプレートはソース3の位置、測定プレートは読み取り位置)にデバイスに入れます。黒い先端の箱をソース1チップの位置に置きます。デバイスのドアを閉め、5分間インキュベートしてから、プロトコールを続行します。
- 「Protocol signal test」ボタンを選択して、プレート上のバックグラウンド相対光単位(RLU)と蛍光分散を決定します。新しいウィンドウがポップアップします。「Test signal」を選択します。
手記：このステップでは、蛍光リーダーデバイスの光学コンパートメントに組み込まれたICCD(Intensified Charge-Coupled Device)カメラによってバックグラウンドRLUが決定されます。これらのRLUは、発光ダイオード(LED)(LED出力波長470-495nm)によるCa2+感受性色素(fluo-2)の励起に起因します。8,000〜10,000 RLUの値は、このアプリケーションに最適です。RLUは、必要に応じて、励起強度(Select Exc. Intensity)またはカメラゲート(Select Gate Open)を変更することで適合させることができます。プレート上の分散は、理想的には7.5%未満である必要があります。
- 8,000 から 10,000 RLU のバックグラウンド値が取得された場合は [更新] を選択します。[保存]ボタンをクリックしてメインプロトコルを保存します。
手記：これにより、プロトコル信号テストの設定がメインプロトコルに引き継がれます。
- 「RUN」ボタンを押してアッセイを実行します。
