α-ガラクトシダーゼAおよび酸性α-グルコシダーゼ酵素活性のin vitro測定

要約

出典:Lukas, J., et al. ファブリー病およびポンペ病における薬理学的シャペロン応答性をテストするためのIn Vitro酵素測定。

このビデオは、合成4-メチルウンベリフェリル基質を用いたサンプル中のα-ガラクトシダーゼAと酸性α-グルコシダーゼの酵素活性をin vitroで測定する方法を示しています。

プロトコル

>1. セルハーベストとα-ガラクトシダーゼAまたは酸性α-グルコシダーゼ活性測定

1. セルハーベスト
   1. 収穫の日に、インキュベーターから細胞を取り出し、培地を吸引します。細胞を_Ca2+および_Mg2+.
      のPBSで2回慎重に洗浄します 注:DGJとDNJはそれぞれα-ガラクトシダーゼとα-グルコシダーゼの強力な阻害剤であり、残り物はテストを無効にするため、この手順は重要です。
   2. 200 μLの脱イオン水を直接細胞の上に加えます。プレートから細胞をすすぎ、1.5mLの反応チューブに移します。

2. 凍結融解による均質化

1. サンプルを適切なフォームラックに入れ、5秒間ボルテックスして溶解をより効率的にします。サンプルを交互に液体窒素に10秒間入れ、融解が完了するまで室温の水浴に入れます(5分間)。
2. この手順を5回繰り返し、サンプルを10,000 x gで5分間回転させ、上清とピペットを新しい反応チューブに保持します。

>3. ビシンコニン酸(BCA)アッセイによるタンパク質濃度測定

1. 40 μLの脱イオンH₂Oを含む各サンプルに新しいチューブを準備し、10 μLのサンプルを追加します。溶液を短時間ボルテックスして混合し、10 μLを96ウェルプレートのキャビティに移します(各サンプルは3倍にします)。2 mg/mL のウシ血清アルブミン(BSA)ストック溶液を脱イオン H₂O 中で以下のように希釈し、標準曲線を求めます:50 μL H₂O/50 μL BSA;60 μL H₂O/40 μL BSA;70 μL H₂O/30 μL BSA;80 μL H₂O/20 μL BSA;90 μL H₂O/10 μL BSA;100 μL H₂O.
2. 200 μLのBCA試薬(試薬Aと試薬Bを50:1の比率で混合)を加えて反応を開始し、オービタルシェーカー(300 rpm)でわずかに攪拌しながら、37°Cの暗所で1時間インキュベートします。プレートリーダーで560nmの吸光度を測定します.
   手記：サンプルには通常、1μLあたり1〜1.5μgのタンパク質が含まれています。

4. 人工4-メチルウンベリフェリル基質(4-MUG)による酵素活性測定

1. 各サンプルの計算量を希釈し、ピペットで新しい1.5 mL反応チューブにピペットで移し、0.05(α-ガラクトシダーゼAの場合)または0.5(酸性α-グルコシダーゼの場合)μgタンパク質/μL溶液を得ます。サンプルを再び5秒間ボルテックスし、この希釈液の10μLを96ウェルプレートにピペットで移します(各サンプルは重複しています)。
2. 反応を開始するには、それぞれの基質溶液を20 μL加えます:
   α-ガラクトシダーゼAの場合:0.06 Mリン酸クエン酸緩衝液中の2 mM 4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクトピラノシド(4-MU-gal)、pH 4.7.
   酸性α-グルコシダーゼの場合:0.025 M酢酸ナトリウム、pH 4.0中の2 mM 4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド(4-MU-glu)。
3. オービタルシェーカー(300 rpm)でわずかに攪拌しながら、37°Cの暗所で酵素反応を1時間インキュベートします。1.0 M、pH 10.5調整したグリシン-NaOHバッファーを200 μL添加して反応を終了します。
4. 0.01 mg/mL のストックから 4-メチルウンベリフェロン (4-MU) の標準曲線を次のように調製します:
   100 μL H2O/いいえ4-MU;80 μL H2O/ 20 μL 4-MU;60 μL H₂O/ 40 μL 4-MU;40 μL H₂O/ 60 μL 4-MU;20 μL H₂O/ 80 μL 4-MU;H₂O/100 μL 4-MUなし、各希釈液10 μLを96ウェルプレート(重複)にピペットで移し、容量とpHを調整するために、1.0 Mグリシン-NaOHバッファー200 μLを各ウェルに加えます。
5. 適切なフィルターセットを装備した蛍光リーダーで酵素活性を測定し、蛍光リーダーデバイスに適したソフトウェアを使用してデータを分析します。
   手記：両方の4-MUG基質は、α-ガラクトシダーゼAまたは酸性α-グルコシダーゼへの曝露中に4-MUに還元されます。今回発売された4-MUは蛍光色素で、励起波長は360nm、発光波長は465nmで、マイクロプレート蛍光リーダーで測定できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	1,06,40,41,000
塩化カリウム	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	1,04,93,60,500
MgCl2 x 6H2O	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	1,05,83,30,250
D(+)-グルコース一水和物	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	1,08,34,22,500
水酸化ナトリウム	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	1,06,49,80,500
酢酸ナトリウム	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	1,06,26,40,050
HEK293H細胞株	Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ	11631-017
SafeSeal 反応チューブ、1.5 mL	ザルシュテット、ニュンブレヒト、ドイツ	72,706
Tecan GENiosリーダー	Tecan, Männedorf, スイス
マゼランデータ分析ソフトウェア v6.6	Tecan, Männedorf, スイス	N.Aさん

千株