ウイルス不活化アッセイによる抗ウイルス試験化合物の有効性の評価

要約

出典:Tai, C. et al., Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、抗ウイルス剤がウイルス粒子に与える影響の評価を示す、ウイルス不活化アッセイを示しています。

プロトコル

1. ウイルス不活化アッセイ

注:さまざまなウイルスの潜伏期間とウイルス量の例を図1Aに示します。ウイルスの高濃度は、MOI/PFUを増やすことによってもテストできます。

1. 96ウェルプレート(1ウェルあたり1 × 10⁴細胞)にHuh-7.5細胞を播種し、5% CO₂インキュベーターO / Nで37°Cでインキュベートして単分子膜を得ます。
2. 試験化合物またはコントロールをインキュベートします(最終濃度:CHLA = 50 μM;PUG = 50 μM;ヘパリン= 1,000μg/ ml;DMSO = 1%)で、HCV粒子を37°C(図1A、「長期」)で1:1の比率で測定しました。例えば、1 x 104 FFUを含む100 μLのウイルス接種液に、100 μLの100 μMのCHLA作動希釈液を添加します。これにより、最終濃度50μMでのCHLA処理が得られます。
3. ウイルスと薬物の混合物を、試験化合物の「治療以下の」(効果のない)濃度に希釈します。例えば、HCVに対するCHLAおよびPUGの非効果濃度は1μM31です。したがって、これにはウイルス-薬物混合物の50倍希釈が必要であり、これは9.8mlの基礎培地(2%FBSを含む細胞培養培地)で達成できます
   注:治療以下の濃度に希釈すると、試験化合物と宿主細胞表面との間の大きな相互作用が防止され、無細胞ビリオンに対する治療効果を調べることができます。この希釈は、特定のウイルス感染に対する試験化合物の抗ウイルス用量応答に依存し、この特定のアッセイを実施する前に決定されることに留意されたい。
4. 比較のために、ウイルスを試験化合物と混合し、感染前に直ちに治療以下の濃度まで希釈(インキュベーション期間なし)します(図1A、「短期」)。
5. 希釈したHCV薬物混合物100 μlをHuh-7.5細胞単層(ウイルス量は1 x 10² FFU、最終MOI = 0.01)に加え、37°Cで3時間インキュベートしてウイルスを吸着させます。
6. 感染後、希釈した接種物を取り出し、200μlのPBSでウェルを2回優しく洗浄します
   手記：細胞が浮き上がらないように、やさしく洗浄してください。
7. 各ウェルに100 μlの基礎培地を適用し、37°Cで72時間インキュベー
トします。
8. 上清のルシフェラーゼ活性をアッセイすることにより、結果として生じる感染を分析します。

結果

図 1.試験化合物CHLAおよびPUGによるウイルス感染の不活性化。さまざまなウイルスを試験化合物で長期間(滴定前に1.5〜3時間インキュベート、薄い灰色のバー)または37°Cで短期間(すぐに希釈、濃い灰色のバー)処理してから、治療以下の濃度に希釈し、その後、それぞれの宿主細胞の感染を分析しました。(A)実験の概略図(左図)と、最終ウイルス濃度(PFU/wellまたはMOI)、長期ウイルス-薬物インキュベーション期間(i)、およびその後のインキュベーション時間(ii)を右の表の各ウイルスに示した。(B)HCMV、(C)HCV、(D)DENV-2、(E)MV、および(F)RSVの解析は、各追加パネ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	ギブコ	11995年040
FBSの	ギブコ	〒26140-079
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15070-063
アムホテリシンB	ギブコ	15290から018
DMSOの	シグマ	D5879
In vitro 毒性アッセイキット、XTTベース	シグマ	トックス2
PBSのpH 7.4	ギブコ	10010023
マイクロプレートリーダー	サーモサイエンティフィック	89087-320
マイクロ遠心分離機	サーモサイエンティフィック	75002420
BioLux Gaussia ルシフェラーゼアッセイキット	ニューイングランドバイオラボ	E3300Lの
ルミノメーター	プロメガ	グロマックス-20/20
クエン酸ナトリウム、二水和物	シグマ	71402
塩化カリウム	シグマ	P5405