宿主細胞へのウイルス侵入と融合に対する被験化合物の影響を評価するためのアッセイ

要約

出典:Tai, C., et al. 早期ウイルスエントリーアッセイによる抗ウイルス化合物の同定と評価のための早期ウイルスエントリーアッセイ. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、ウイルスが宿主細胞に侵入し、エンドソームと融合する特定のステップを標的とする抗ウイルス剤を評価するためのアッセイを示しています。細胞を低温でインキュベートした後、HCVに感染させます。低温は宿主細胞へのウイルスの結合を可能にしますが、エンドサイトーシスによる内在化を阻害します。試験用抗ウイルス化合物を添加し、細胞を生理的温度でインキュベートします。この高温へのシフトにより、ウイルスの侵入が容易になり、エンドソームとのウイルスエンベロープ融合に対する試験化合物の影響を評価できます。

プロトコル

>注:細胞培養とウイルス感染を含むすべての手順は、取り扱うサンプルのバイオセーフティレベルに適した認定バイオセーフティフードで実施されていることを確認してください。プロトコルを説明する目的で、Gaussia luciferase レポータータグ付き HCV をモデルウイルスとして使用します。代表的な結果に関連して、化合物のケブラギン酸(CHLA)とプニカラギン(PUG)は、ウイルスの早期参入ステップでウイルス糖タンパク質と細胞表面のグリコサミノグリカンとの相互作用を標的とする抗ウイルス薬の候補として使用されます。多くのウイルスの侵入を阻害することが知られているヘパリンは、このような状況でポジティブコントロール治療として利用されています。

>1. 細胞培養、化合物調製、および化合物の細胞毒性

1. 解析するウイルス感染システムのそれぞれの細胞株を増殖させます(表1)。HCVについては、10%ウシ胎児血清(FBS)、200 U/mlペニシリンG、200μg/mlストレプトマイシン、および0.5μg/mlアムホテリシンBを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でHuh-7.5細胞を増殖させます。
2. 試験化合物とコントロールをそれぞれの溶媒を使用して調製します。例えば、CHLAとPUGをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、ヘパリンを滅菌済み再蒸留水で調製します。その後のすべての希釈には、培地を使用します.
   注:試験化合物処理中のDMSOの最終濃度は、実験では1%未満です。1% DMSOは、比較のためにアッセイにネガティブコントロール処理として含まれています。
3. XTT(2,3-ビス[2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルフォフェニル]-5-フェニルアミノ)-カルボニル]-2H-テトラゾリウム水酸化物)などの細胞生存率決定試薬を使用して、ウイルス感染の細胞上の試験化合物(CHLAおよびPUGなど)の細胞毒性を決定します。
   1. HCVの場合、96ウェルプレート(1ウェルあたり1 × 10⁴細胞)にHuh-7.5細胞を播種し、5% CO₂インキュベーターO / Nで37°Cでインキュベートして単分子膜を得ます。
   2. DMSO制御(1%)または試験化合物CHLAおよびPUGの濃度を上げる(例:0、10、50、100、500μM)を培養ウェルに3回適用します。
   3. 37°Cで72時間インキュベートした後、培地をプレートに捨て、200 μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回洗浄します。
   4. XTTベースのin vitro毒性アッセイキットから100 μlのアッセイ溶液を各ウェルに加え、プレートを37°Cでさらに3時間インキュベートして、XTTホルマザンを作製します。
   5. マイクロプレートリーダーを使用して、試験波長492 nm、基準波長690 nmの吸光度を測定します。
   6. 次の式を使用して、生存細胞の割合を計算します:細胞生存率(%)= At/As×100%ここで、「At」と「As」はそれぞれ試験化合物と溶媒制御(例:1% DMSO)処理の吸光度を示します。GraphPad Prismなどの分析ソフトウェアから、メーカーのプロトコルに従って、試験化合物の50%細胞毒性(CC₅₀)の濃度を決定します。

2. ウイルス感染の読み出し

注:ウイルス感染の読み出しは、使用されるウイルスシステムによって異なり、プラークアッセイやレポータータグ付きウイルスからのレポーターシグナルの測定などの方法が含まれる場合があります。ルシフェラーゼレポーター活性に基づくレポーターHCV感染の検出方法について以下に説明する。

1. 感染したウェルから上清を回収し、17,000 x gで微量遠心分離機で4°Cで5分間清澄化します。
2. Gaussiaルシフェラーゼアッセイキットから20 μlの試験上清を50 μlのルシフェラーゼ基質に混合し、製造元の指示に従ってルミノメーターで直接測定します。
3. HCV感染性を相対光単位(RLU)の_log10として表し、ウイルス阻害(%)を決定し、メーカーのプロトコルに従ってGraphPad Prismソフトウェアのアルゴリズムを使用してHCV感染に対する試験化合物の50%有効濃度(EC₅₀)を計算します。

3. ウイルスエントリー/融合アッセイ

>注:さまざまなウイルスの潜伏期間とウイルス量の例は、図1A「Entry/Fusion」にリストされています。ウイルスの高濃度は、MOI/PFUを増やすことによってもテストできます。

1. 96ウェルプレート(1ウェルあたり1×10個の⁴細胞)でHuh-7.5細胞を播種し、5%_CO2インキュベーターO / Nで37°Cでインキュベートして単層を得ます。
2. 細胞単分子膜をプレート内で4°Cで1時間予冷します。
3. HCV(Multiplicity of Infection, MOI = 0.01)を4°Cで3時間感染させます。たとえば、1 x 10² フォーカス形成ユニット (FFU) を含む 100 μl のウイルス接種液を使用します。
   手記：氷上でウイルス接種物を添加し、その後4°Cの冷蔵庫でインキュベーションして温度を4°Cに維持します。これにより、ウイルスの結合は可能になりますが、侵入はできません。
4. 上清を取り除き、細胞単層を氷冷PBS200μlで2回優しく洗浄します
   手記：細胞が浮き上がらないように、やさしく洗浄してください。
5. ウェルを試験化合物またはコントロールで処理します(最終濃度はCHLA = 50 μM;PUG = 50 μM;ヘパリン= 1,000μg/ ml;DMSO = 1%)でインキュベートし、37°Cで3時間インキュベートします。例えば、500 μM CHLAワーキング希釈液10 μlを90 μlの培地に加え、ウェルを混合して処理します。これにより、最終濃度50 μM.
   でのCHLA処理が得られます 手記：4°Cから37°Cへのシフトにより、ウイルスの侵入/融合イベントが容易になり、この特定のステップに対する試験化合物の影響を評価できるようになりました。
6. 薬剤含有上清を吸引し、200 μlのクエン酸緩衝液 (50 mM クエン酸ナトリウム、4 mM 塩化カリウム、pH 3.0) または PBS で洗浄して、非内挿性細胞外ウイルスを除去します。基礎培地100 μlをアプスした後、37°Cで72時間インキュベー
トしてください。
7. '2 で説明されているように、上清のルシフェラーゼ活性をアッセイすることにより、結果として生じる感染を分析します。ウイルス感染の読み出し」。

結果

>表 1: ウイルス感染の宿主細胞の種類。代表的な結果に記載されている各ウイルス感染システムに使用される細胞の種類が示されています。

の

ウイルス	細胞の種類
ホーチミン	ヘル
HCVの	ハハ-7.5
DENV-2	ベロ
MV	チョースラム
出欠確認	HEp-2

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	ギブコ	11995年040
FBSの	ギブコ	〒26140-079
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15070-063
アムホテリシンB	ギブコ	15290から018
DMSOの	シグマ	D5879
In vitro 毒性アッセイキット、XTTベース	シグマ	トックス2
PBSのpH 7.4	ギブコ	10010023
マイクロプレートリーダー	バイオテック・インストゥルメント(株)	ELx800
マイクロ遠心分離機	サーモサイエンティフィック	75002420
BioLux Gaussia ルシフェラーゼアッセイキット	ニューイングランドバイオラボ	E3300Lの
ルミノメーター	プロメガ	グロマックス-20/20
クエン酸ナトリウム、二水和物	シグマ	71402
塩化カリウム	シグマ	P5405

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