修正リトマス試験紙を用いた細菌バイオマーカーの比色検出

要約

出典:Tram, K., et al. Litmus Testを使用した細菌の比色検出。

このビデオは、大腸菌バイオマーカーがDNAzymeを活性化し、RNA結合の切断とDNAzyme-ウレアーゼ複合体の分離をもたらす比色大腸菌検出法を示しています。その後の比色アッセイでは、アンモニアによるpH変化を通じて大腸菌バイオマーカーを検出します。

プロトコル

1. 大腸菌細胞の試験準備

1. 目的の細胞懸濁液を得るには、1 mLの培養ストックを1.5 mLのマイクロチューブに移します。
2. 細胞を6,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に除去します。
3. 反応バッファー10μlを細胞ペレットに加え、細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を5分間超音波処理します。細胞懸濁液をアイスボックスに5分間移します。
4. 細胞懸濁液をさらに5分間超音波処理します。
5. 細胞懸濁液を13,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を試験用(10 μl)に使用します。

2. リトマス試験紙

1. 1.5 mLのマイクロチューブで、100 μlの反応バッファー (RB) をマイクロチューブに添加してボルテックスし、バッファーを廃棄してチューブを予備洗浄します。
2. アセンブルしたEC1 15 μlを洗浄したマイクロチューブに移します。
3. マイクロチューブを磁気ラックに置いて、磁気ビーズを洗浄します。ピペッティングで上清を取り除きます。マイクロチューブをラックから取り出し、100 μlのRBを加え、磁気ビーズを慎重に再懸濁します。
4. 手順2.3を繰り返して、MBをさらに2回洗います。
5. マイクロチューブを磁気ラックに戻し、上清を取り除き、ステップ1.3で調製した10 μlの大腸菌サンプルを加えます。
6. サンプルと磁気ビーズを、マイクロフュージチューブを軽くたたいて慎重に混合します。
7. 反応物を室温で1時間インキュベートします。
8. 反応液に90μlのddH₂Oを加え、マイクロチューブを磁気ラックに置きます。
9. 磁気分離の約3分間後、上清85μlを0.5 mLのマイクロチューブに慎重に移します。磁気ビーズが溜まらないように、上清をゆっくりと引き出します。
10. 上記のマイクロチューブに、0.04%フェノールレッド15μlと基質溶液100μlを加えます。
11. 色の変化を記録するために、特定の時間間隔で写真を撮ります.
    手記：pHの変化は、微小電極を備えたpHメーターを使用して監視することもできます。開始pHは約5.2〜5.5である必要があります(溶液は黄色です)。そうでない場合は、1 mM Acetate Buffer pH 5.0)を添加して溶液を調整できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	VWRアムレスコ	105
水酸化ナトリウム(NaOH)ペレット	バイオベーシックカナダ株式会社	SB6789
トリスベース	VWRアムレスコ	497
尿素	VWRアムレスコ	M123
キシレンシアノールFF	シグマ・アルドリッチ	X-4126
0.04%フェノールレッド	シグマ・アルドリッチ	P3532
10x T4ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー	ルシジェン	30061-1
大腸菌K12(MG1655)	ATCCの	ATCC700926
磁気ビーズ(BioMag)	バングスラボラトリーズ株式会社
マグネティックセパレーションラック	ニューイングランドバイオラボ	S1506Sの
マイクロチューブ	ザルシュテット	72円69
細胞培養インキュベーター	エッペンドルフ・サイエンティフィック	M13520000
ブランソン超音波洗浄機	ブランソン	該当なし