ポックスウイルス感染細胞における翻訳制御を研究するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ

要約

出典:Dhungel, P., et al. In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、ポックスウイルス感染細胞の翻訳制御を研究するためのアッセイを示しています。非感染細胞とウイルス感染細胞に、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)およびレニラルシフェラーゼ(Rluc)をコードするmRNAを同時トランスフェクトし、Fluc mRNAには5'ポリ(A)リーダー配列が含まれていました。溶解した細胞に生物発光基質を添加した後、両方のルシフェラーゼからのシグナルを測定して、リーダー配列によって付与されるウイルス感染細胞におけるFluc mRNAの翻訳上の利点を特定します。

プロトコル

1. mRNAを細胞にトランスフェクション

する

1. 24ウェルプレート(翌日には約80~90%がコンフルエントになる)でHeLa細胞を播種し、37°Cのインキュベーターで5% CO₂と一晩インキュベー
トします。
2. HeLa細胞を感染多重度(MOI)5でワクシニアウイルス(VACV)に感染させるか、比較のために非感染HeLa細胞を保持します
   手記： MOIは、細胞あたりの感染性ウイルス粒子の数です。
3. XのMOI = {[(細胞数 * X) / ウイルス力価] * 1000} μl 1 mL培地あたりのウイルス
。
4. 感染後所望時間(hpi)(この実験では10-12 hpi)の後、図1Cに示すように、カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用してmRNA(24ウェルプレートのウェルあたり500 ngの総mRNA)をトランスフェクションします。
   1. 24ウェルプレートの1ウェルについて、ホタルルシフェラーゼ(12A-Fluc)mRNAを持つ12A配列480 ngとRenillaルシフェラーゼ(Kozak-Rluc)mRNAを持つコザック配列20 ngを1つの微量遠心チューブに混合します。別の微量遠心チューブに、1.1 μLのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を加えます。
   2. 両方のチューブに55 μLの還元血清培地を加えます。混合し、室温で5分間インキュベートします。
   3. インキュベーションの5分後、mRNA mRNA含有チューブに還元血清培地を含む55 μLのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を加えます。
   4. 穏やかに、しかし十分に混合し、室温で15分間インキュベートします。
   5. インキュベーション中に、細胞培養培地を取り出し、24ウェルプレートのウェルあたり400 μLの還元血清培地を加えます。
   6. インキュベーション後、100 μLの混合物を24ウェルプレートの1ウェルに滴下し、均一に添加します。

2. ルシフェラーゼ活動の測定

1. 12A-FlucおよびKozak-Rluc mRNAの同時トランスフェクションから5時間後に、2つのレポーターアッセイを実行できるルシフェラーゼアッセイシステム(Dual-Luciferase Reporterアッセイキットなど)を使用してルシフェラーゼ活性を測定します。
2. 還元した血清培地を取り出し、ルシフェラーゼアッセイキットの成分である150 μL 1x Lysis Bufferを添加して細胞を溶解します。
3. 室温で10分間インキュベートした後、細胞をスクラップしてライセートを回収し、微量遠心チューブに移します。
4. ライセートを12,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化します。
5. 底が固い不透明な壁の96ウェル白色アッセイプレートに30 μLの上清を加えます。
6. ルシフェラーゼアッセイキットとマルチモードプレートリーダールミノメーターを使用して、デュアルルミネセンスを測定します。
7. 表1.
   に記載されている設定を使用して、キネティクス機能(ウェル単位)を使用して測定を実行します 手記：読み取りは、手動ルミノメーターを使用して行うこともできます。キュベットに等量のFlucのライセートと基質を加えます。2秒待ってから、ルミノメーターを使用して10秒間測定します。Flucの測定後、ルミノメーターからキュベットをすばやく取り出し、Rlucの基質を等量手動で追加します。再度、2秒待ってから、光度計を使用して10秒間測定します。
8. 発光読み取りデータを目的のファイル形式にエクスポートします。
9. 非感染およびVACV感染HeLa細胞における12A-Fluc mRNAからの相対翻訳速度を、Fluc値を内部制御のRluc値で割ることにより決定します
   注:図2は、相対的なFluc活性を得るための生データの段階的な分析を示しています。

>表1:ルシフェラーゼ測定設定 - 推奨容量または時間でのルシフェラーゼ測定の手順。

ステップス	ボリューム/時間
ルシフェラーゼアッセイ基質(FLUC)を注入します。	30μL
待機/インキュベーション時間:	2秒
発光測定(FLUC):	10秒
Stop & Glo Substrate (Rluc) (Rluc) (停止 & Glo 基板) ):	30μL
待機/インキュベーション時間:	2秒
発光測定(Rluc):	10秒

結果

図1:mRNA合成とトランスフェクション。(A)in vitro転写の模式図。目的の5'-UTRの下流にあるルシフェラーゼ遺伝子とT7プロモーターを含むPCRによって増幅されたDNAをテンプレートとして使用します。T7 RNAポリメラーゼはプロモーターに動員され、白で示されているリボヌクレオチドを5'から3'方向に付加します。mRNAの長さが25〜30 ntになったら、アンチリバースキャップアナログであるARCAを使用してm7Gキャップを追加します。(B)in vitro転写由来のRNAバンドを1.5%アガロースTBEゲル電気泳動を用いて検出した。(C)レポーターmRNAの細胞内へのトランスフェクションを示す模式図。レポーターmRNAまたはカチオン性脂質トラン...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Corning 96ウェルハーフエリアホワイトフラットボトムポリスチレンマイクロプレート	コーニング	3693	不透明な壁の96ウェル白いプレート、底がしっかりしています
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム	プロメガ	E1960	デュアルルシフェラーゼアッセイキット(DLAK)
GloMax Navigator マイクロプレートルミノメーター	プロメガ	GM2010	マルチモードプレートリーダールミノメーターと呼ばれる
リポフェクタミン 2000	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11668019	カチオン性脂質トランスフェクション試薬
オプティMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31985070	血清培地の減少

名 の