抗生物質の最小阻害濃度を評価するためのマイクロタイタープレート法

要約

出典:Ketelboeter, L. M., et al. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、細菌に対する試験用抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を決定するためのマイクロタイタープレートベースの方法を示しています。細菌性病原体Pseudomonas aeruginosaの懸濁液を、試験用抗生物質の段階希釈液を含むマイクロタイタープレートに加え、細菌によるピオメラニン産生の阻害剤を添加すると、ウェルの光学密度を測定して、抗生物質の最小阻害濃度を計算し、ピオメラニン産生阻害剤の影響を細菌の抗生物質感受性に計算します。

プロトコル

1. 96ウェルプレートにおける抗生物質最小阻害濃度(MIC)アッセイ

1. LB(Luria-Bertani)で試験する菌株の一晩培養をNTBC(2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン)の有無にかかわらず設定します
   手記：このプロトコルは、代表レベルの300μM NTBCを使用して説明されています。
   1. 2 mL LBに300 μM NTBCを添加し、NTBCなしの状態の場合、2 mL LBに等量のビヒクル(ジメチルスルホキシド、DMSO)を添加します。
   2. 滅菌爪楊枝を使用して、細菌の1つの分離されたコロニーをチューブに接種します。各系統には、NTBCを持つ文化とNTBCを持たない文化が1つずつ存在します。エアインキュベーター内の組織培養ローテーターを使用して曝気しながら、37°Cで一晩インキュベートします。
2. 翌日、LB + NTBCおよびLB + DMSOマスターソリューションを作成して、MICアッセイを設定します。NTBCを600μMの濃度で添加すると、接種物を添加すると2倍に希釈され、最終濃度は300μMになります。
   1. 1つの菌株に対して1つの抗生物質をテストするには、600 μM NTBCを2 mLのLBに加え、混合してNTBCマスター溶液を調製します。等量のビヒクル(DMSO)を2 mL LBに加え、混合してNTBCなしマスター溶液を作製します。これらのソリューションは、抗生物質ストック溶液の作成や、96ウェルプレートでの希釈シリーズの設定に使用します><。 手記：マスター溶液の配合は、ピペッティングエラーを説明するための追加の溶液を生成します。マスターソリューションは、試験する抗生物質や菌株の数に応じて、必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができます。
3. LB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液で抗生物質溶液を調製します.
   手記：これらの溶液中の抗生物質濃度は、最終的な所望濃度の2倍にする必要があります。100 μlを96ウェルプレートの4つのウェルに移すのに十分な溶液を作る必要があります。
   1. ゲンタマイシン+/-NTBCストック溶液を64μg / mlで調製します。この溶液を作るには、0.288 μl のゲンタマイシンストック (100 mg/ml) を 450 μl の LB + NTBC または LB + DMSO マスター溶液に加えます
      注:緑膿菌PAO1のゲンタマイシンの最大濃度は32μg / mlです。.
   2. カナマイシン+/-NTBCストック溶液を256μg / mlで調製します。この溶液を調製するには、3.84 μl のカナマイシンストック (30 mg/ml) を 450 μl の LB + NTBC または LB + DMSO マスター溶液に加えます
      手記：緑膿菌PAO1に対するカナマイシンの最大濃度は128μg/ mlです。
   3. トブラマイシン+/-NTBCストック溶液を8μg / mlで調製します。.この溶液を調製するには、0.36 μl のトブラマイシンストック (10 mg/ml) を 450 μl の LB + NTBC または LB + DMSO マスター溶液に加えます
      手記： 緑膿菌PAO1の場合、トブラマイシンの最大濃度は4μg/ml
      です。 手記：抗生物質と濃度は、試験する細菌に合わせて調整できます。
4. 2倍抗生物質溶液各100 μlを96ウェルプレートの4つのウェルに加えます。これらのソリューションを行 A に配置します。たとえば、ゲンタマイシンはA1からA4に、カナマイシンはA5からA8に、トブラマイシンはA9からA12に配置する必要があります。.96ウェルプレートのセットアップの図については、図1Aを参照してください.
   手記： 1つのプレートで複数の抗生物質を試験できますが、他の菌株からの交差汚染の可能性を排除するために、1つのプレートにつき1つの菌株のみを試験する必要があります。
5. LB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液50 μlを96ウェルプレートの列BからHまで加えます。1 つのプレートが LB + NTBC で、1 つのプレートが LB + DMSO であることを確認します。図 1A を参照してください。
   1. LB + NTBCの抗生物質にはLB + NTBCを使用してください。LB+DMSOの抗生物質にはLB+DMSOを使用してください。
6. マイクロピペッターを使用して、溶液50μlを列Aから列Bに移すことにより、抗生物質の2倍段階希釈を行います。溶液を混合し、ピペットチップを交換し、溶液50μlを列Bから列Cに移します。行Gを希釈した後、その列から溶液50μlを取り出して廃棄します。H列は、細菌増殖のための抗生物質不使用のコントロールとして使用します。図 1B.
   を参照してください。 注:行AからGの各ウェルには、LB + NTBCまたはLB + DMSOに50 μlの抗生物質が最終的な所望濃度の2倍で含まれています。行Hには、抗生物質を含まないLB + NTBCまたはLB + DMSOが含まれています。
7. 一晩の培養の_OD600を測定します。OD₆₀₀の測定値を取得する前に、すべての培養物を洗浄して、メディアに存在するピオメラニンを排除します。
   1. 1 mLの培養物を16,000 x gの微量遠心分離機で2分間遠心分離して培養物を洗浄し、マイクロピペッターで上清を除去し、細胞ペレットを1 mL LBに再懸濁します。
8. 一晩培養液を LB.
   5 CFU/ml に希釈します> 手記：1 OD₆₀₀ ユニットが P. aeruginosa の 1x10⁹ CFU/ml に相当すると仮定します。ODからCFU/mlへの変換は、他の細菌では異なる場合があります。
9. 希釈した細菌培養物50 μlを適切なウェルに加えます。
   手記： NTBCで増殖した培養物はNTBCを含むウェルに、DMSOで増殖した培養物はDMSOを含むウェルに追加する必要があります。図 1B を参照してください。
   1. 各菌株および抗生物質濃度の3つのウェルに細菌を追加します。50 μlのLBを4番目のウェルに加えて、細菌汚染のコントロールとして機能します。図 1B を参照してください。
   2. マルチチャンネルマイクロピペッターを使用して、ウェルに接種します。接種物を追加するときは、隣接するウェルの汚染を防ぐために、ピペットの先端がウェルの底近くにあることを確認してください.
      手記：ウェルに細菌培養物を追加すると、抗生物質とNTBCの濃度が2倍に希釈されます。
10. 96ウェルプレートをパラフィルムで覆い、37°Cで約24時間インキュベートします。96ウェルプレートをエアインキュベーターで静的にインキュベートします。
11. プレートのウェル内での細菌の増殖を調べます。MICは、各株の3回の複製すべてで細菌の増殖が見られない最も低い抗生物質濃度です。
    1. プレートの成長を目視で確認するか、OD₆₀₀に設定されたプレートリーダーを使用して読み取ります。

結果

図1:抗生物質MICアッセイ96ウェルプレートセットアップの概略図(A)開始濃度が最も高い2x抗生物質100 μlがA列にあり、B列からH列BからHには、抗生物質を含まないLB + NTBCまたはLB + DMSOのいずれか50 μlが充填されています。(B)A列からG列で2倍段階希釈を行い、各ウェルで50μlの希釈抗生物質を最終所望濃度の2倍で調製します。Row Hは、抗生物質を使用しない細菌増殖のコントロールウェルです。50 μlのLBまたは接種物を適切なウェルに添加し、抗生物質を最終濃度の2倍に希釈します。LBは、抗生物質の細菌汚染のコントロールとして機能します。Gm、ゲンタマイシン;キロ、カナマイシン;トブ、トブラマイシン

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)	シグマ・アルドリッチ	SML0269-50mg	ニチシノンとも呼ばれます。DMSOに可溶です。
H2O2	シグマ・アルドリッチ	216763から100ミリリットル	30 wt. % in H2O. 安定化。
ゲンタマイシン	ゴールドバイオ	G-400-100	H2O.フィルター滅菌に可溶です。
カナマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP906-5	H2O.フィルター滅菌に可溶です。
トブラマイシン	シグマ・アルドリッチ	T4014-100MG	H2O.フィルター滅菌に可溶です。