細胞外マトリックスの硬直が細菌感染に及ぼす影響を研究するためのアッセイ

要約

出典: Bastounis, E. E., et al. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、接着細胞の細菌感染に対する細胞外マトリックス(ECM)硬化の影響を研究するためのアッセイを示しています。さまざまな硬さのポリアクリルアミドハイドロゲルをコラーゲンで重ね合わせたマルチウェルプレートに重ね合わせることで、生理的ECMの硬さを模倣します。ヒト内皮細胞をハイドロゲル上に重ね合わせ、細胞内で蛍光タンパク質を発現するように設計されたリステリア菌を細胞に感染させると、フローサイトメトリーを使用して、硬いハイドロゲル上に存在する細胞内の内在する細菌と柔らかいハイドロゲル上に存在する細菌を比較します。

プロトコル

>1. マルチウェルプレート上での薄い2層ポリアクリルアミド(PA)ハイドロゲルの作製

1. ポリアクリルアミドヒドロゲル製造
   手記： 図 1 を参照してください。
   1. 40%ストックアクリルアミド溶液(材料表を参照)の3〜10%と2%ストックビスアクリルアミド溶液(材料表を参照)の0.06〜0.6%を含む水溶液を調製して、0.6 kPa〜70 kPaの範囲の調整可能な剛性のヒドロゲルを製造します。表 1 を参照してください。
      1. 0.6 kPaのハイドロゲルの場合、3%アクリルアミドと0.045%ビスアクリルアミドを混合します。3 kPa ヒドロゲルの場合、5% アクリルアミドと 0.074% ビスアクリルアミドを混合します。10 kPa のヒドロゲルの場合、10% アクリルアミドと 0.075% ビスアクリルアミドを混合します。20 kPa のハイドロゲルの場合、8% アクリルアミドと 0.195% ビスアクリルアミドを混合します。70 kPa のハイドロゲルの場合、10% アクリルアミドと 0.45% ビスアクリルアミドを混合します.
         注:望ましいPAハイドロゲル剛性の達成に関する詳細は、他の場所で見つけることができます。
   2. 必要なヒドロゲルの硬さごとに2つの水溶液を調製します。溶液 1 をビーズフリーにし、溶液 2 に直径 0.03% 0.1 μm の蛍光マイクロビーズを含有するように調製します (材料表を参照)。
   3. 溶液1および2を真空で15分間デガスし、溶液の重合を阻害することが知られている酸素を除去します。
   4. 10 g/mLストックAPS溶液の0.6%と0.43%テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を溶液1に加えて、重合開始を有効にします。迅速に行動する。
   5. 3.6 μLの溶液1を24ウェルディッシュの各ウェルの中央に加えます。
   6. 直ちにウェルを12 mmの未処理の円形カバースリップで覆い、溶液1を20分間放置して完全に重合させます。
   7. シリンジ針を表面に軽くたたいて、カバースリップの取り外しを容易にするために、その先端に小さなフックを作成します。シリンジ針を使用してカバースリップを持ち上げます。
   8. 溶液2に10 g/mLストックAPS溶液の0.6%と0.43%TEMEDを添加します。24ウェルディッシュの各ウェルの第1層の上に2.4μLの混合物を堆積させます。
   9. ソリューション2を12mmの円形ガラスカバースリップで覆い、一対の鉗子を使用して下にそっと押し下げ、2番目の層の厚さが最小限に抑えられるようにします。溶液2を20分間重合させます。
   10. 500 μL の 50 mM HEPES pH 7.5 を各ウェルに加え、シリンジ針と鉗子でガラスカバースリップをはがします。
2. ポリアクリルアミドハイドロゲルの滅菌、コラーゲンコーティング、平衡化
   1. 組織培養フード内でハイドロゲルを1時間UV露光し、滅菌を可能にします。
   2. 0.5% 重量/体積のスルホスクシンイミジル 6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート (Sulfo-SANPAH、材料の表を参照) の混合物を 1% DMSO および 50 mM HEPES pH = 7.5 で調製します。
   3. この溶液200μLをハイドロゲルの上面に加えます。迅速に行動し、UV(302 nm)に10分間さらして活性化します。
   4. ヒドロゲルを1 mLの50 mM HEPES pH = 7.5で2回洗浄します。必要に応じて繰り返して、余分な架橋剤が除去されていることを確認します。
   5. ハイドロゲルを200 μLの0.25 mg/mLラットテールコラーゲンI(材料表を参照)で50 mMのHEPESにタンパク質コーティングします。コラーゲン溶液を上にして、ハイドロゲルを室温で一晩インキュベートします
      手記：脱水/蒸発を防ぐために、マルチウェルプレートを二次格納容器に置き、格納容器の内周に水に浸した実験室洗浄組織を追加します。
   6. 40倍対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、ハイドロゲルの厚さを測定します。これを行うには、ヒドロゲルの底面(ガラス面がある場所)と上面(蛍光ビーズの強度が最大)のz位置を特定します。次に、z 位置を減算して高さを決定します。
      手記：倒立落射蛍光顕微鏡と開口数0.65の40倍対物レンズを使用して、ハイドロゲルの厚さを測定しました。この時点で原子間力顕微鏡測定(AFM)も実行して、ハイドロゲルの正確な剛性を確認することもできます(図2を参照)。
   7. 目的の細胞をハイドロゲルに播種する前に、ハイドロゲル上に1 mLの培地を加え、37°Cで30分間から1時間インキュベートして平衡を確保します
      手記：MCDB-131フル培地は、モデル宿主細胞(HMEC-1)が培養された培地であるため、追加しました(詳細についてはステップ2.1を参照)。

2. ヒト微小血管内皮細胞の培養とハイドロゲルへの播種

1. 10% ウシ胎児血清、10 ng/mL の上皮成長因子、1 μg/mL のヒドロコルチゾン、および 2 mM の L-グルタミンを添加した MCDB-131 培地を含む MCDB-131 フル培地で HMEC-1 (ヒト、微小血管内皮) 細胞を培養します (材料の表を参照)。
2. コンフルエント培養物を3〜4日ごとに1:6に分割し、細胞を継代40まで保持します。
3. 実験の1日前に、0.25%トリプシン/EDTAを使用して細胞を培養容器から切り離します。まず、細胞とその培養容器を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、次に適切な量の0.25%トリプシン/EDTA(100 mmディッシュまたは75 cmフラスコあたり2 mL、60 mmディッシュまたは25 cmフラスコあたり1 mL)を加え、フラスコを37°Cで5〜10分間インキュベートして、細胞を基質から剥離させます。
4. 所望の量のMCDB-131フル培地を加えてトリプシンを中和し、ピペットで静かに細胞の塊を砕き、溶液を円錐形の遠心分離チューブに入れます。
5. 細胞の溶液を静かに渦巻いて細胞が均一に分布していることを確認してから、20μLの溶液を取り出し、ガラス血球計算盤のカバーガラスの下にある2つのチャンバーに非常に静かに充填します。
6. 円錐形遠心チューブに含まれる細胞の溶液を、500 x gで10分間遠心分離してペレット化します。
7. 10分間の待機期間中に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。顕微鏡を使用し、10倍対物レンズで血球計算盤のグリッド線に焦点を合わせ、ハンドタリーカウンターを使用して1 mm x 1 mmの正方形の細胞数をカウントします。
8. 血球計算盤を別の1 mm x 1 mmの正方形に移動し、そこで細胞を数え、さらに2回プロセスを繰り返します。4 つの測定値の平均を計算し、その平均に 10⁴ を掛けます。最終的な値は、遠心分離される細胞懸濁液中の生細胞数/mLです。
9. 円錐形の遠心分離チューブから液体を取り出し、細胞ペレットが破壊されないようにします。MCDB-131フル培地中の細胞を4 x 10⁵細胞/mLの濃度で再懸濁します。
10. まず、ハイドロゲルをインキュベートした培地を除去し、次に各ハイドロゲルに1 mLの細胞懸濁液を添加することにより、ハイドロゲル上に懸濁液中の細胞を播種します。

>3. ヒト微小血管内皮細胞のL. monocytogenesへの感染

1. 感染の3日前に、グリセロールストック(-80°Cで保存)から使用するLm株を、必要に応じて7.5μg/ mLのクロラムフェニコールと200μg/ mLのストレプトマイシンを含むBHI寒天プレートにストリークアウトします。
   手記：ストリークアウトされる株は、野生型または変異体であり得、構成的に蛍光を発現する(免疫染色のためにJAT1045を用いた)か、またはActAプロモーターの下で蛍光を発現する(フローサイトメトリーまたは牽引力顕微鏡のためにJAT983またはJAT985を用いた)。
2. プレートを37°Cでインキュベートし、個別のコロニーが形成されるまで(1〜2日)します。
3. 感染の前日に、目的の菌株を一晩成長させ、BHI培地で30°Cで150rpmで振とうし、7.5μg/mLのクロラムフェニコール(適切な場合)を加えます。
   1. 5 mLのBHI培地を15 mLのコニカル遠心チューブに入れ、7.5 μg/mLのクロラムフェニコール(適切な場合)を添加し、滅菌済みの10 μLチップを使用して寒天プレートから1つのコロニーを接種します。
4. 翌日、感染の直前に、サンプルを1:5に希釈して、600 nm(OD600)の細菌溶液の光学密度を測定します。BHIのみを含んだキュベットをブランクとして使用します。
5. 一晩培養した培地をOD600を0.1に希釈し、BHI培地で30°Cで2時間振とうしながら、7.5 μg/mLのクロラムフェニコール(適切な場合)とインキュベートして、細菌が対数期の増殖に達するまで待ちます。
6. 細菌溶液のOD600を測定します(約0.2〜0.3と予想されます)。OD600の方が高い場合は、BHIのみで0.2〜0.3に希釈します。
7. 1mLの細菌溶液を微量遠心チューブに入れます。室温で遠心分離を行い、2,000 x gで4分間スピンダウンします。上清を取り除き、組織培養フード内の組織培養グレードのPBS1 mLに細菌ペレットを再懸濁します。バクテリアを室温で2,000 x gで4分間スピンダウンして、さらに2回洗浄します。上清を取り除き、細菌を1mLのPBSに再懸濁します。
8. PBSに再懸濁した細菌10または50 μLを1 mLのMCDB-131フル培地と混合して、感染ミックスを調製し、感染の多様性(MOI;すなわち、宿主細胞当たりの細菌数)は、宿主細胞当たり約50個の細菌、または宿主細胞当たり10個の細菌である。
9. 24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、ハイドロゲルや細胞を破壊しないように注意します。1 mLのMCDB-131フル培地で細胞を1回洗浄し、次に1 mLの細菌を各ウェルに加えます。
10. プレートを蓋で覆い、漏れを防ぐためにプレートをポリエチレン製の食品ラップで包みます。プレートを遠心分離機に置き、サンプルを200 x gで10分間回転させて、浸潤を同期させます。プレートを組織培養インキュベーターに移し、37°Cで30分間インキュベー
トします。
11. サンプルをMCDB-131フルメディアで4回洗浄し、組織培養インキュベーターに移します。さらに30分後、培地を20 μg/mLのゲンタマイシンを補充した培地と交換します。

>4. 宿主細胞の感染に対する細胞外マトリックス硬さ依存性を定量化するフローサイトメトリー

1. コラゲナーゼ5 mgを秤量し、15 mLの円錐形遠心チューブに入れます。0.25%トリプシン-EDTAを10mL加え、よく混ぜます。
2. 感染後8時間後、24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、ウェルを組織培養PBSで1回洗浄します。PBSをウェルから取り出し、200 μLのトリプシン-EDTA/コラゲナーゼミックスを各ウェルに加えます。これを組織培養インキュベーターに10分間置いて、細胞が完全に剥離できるようにします。
3. 各ウェルに新しいピペットを使用し、混合物を8回上下にピペットで動かします。各ウェルに200 μLのフル培地を加えて、トリプシンを中和します。
4. 各ウェルの400μLの細胞溶液を、35μmの細胞ストレーナキャップ付きの5mLポリスチレンチューブに移します(材料の表を参照)。
5. サンプルあたり10,000〜20,000個の細胞をフローサイトメトリーで分析します。フローサイトメトリーによるデータ取得を行い、関連する市販のソフトウェアを使用してウェルあたりの感染細胞の割合を決定します。前方散布図と側面散布図を使用して、セル数の分布の大部分をゲートします.
   注:: これにより、単一細胞の分析が保証され、破片や細胞のダブレットまたはトリプレットが排除されます。
   1. コントロール非感染細胞からの蛍光シグナルを測定し、自家蛍光を除く感染細胞の集団をゲートします。

>表 1.さまざまな剛性のポリアクリルアミド (PA) ハイドロゲルの組成。この表では、所定の剛性 (ヤング率、E) を達成するための 40% アクリルアミド溶液のストックの割合と 2% ビスアクリルアミド溶液のストックの割合を異なる列に示しています。

名 名 名 名 名 名

ヤング率(E、kPa)	アクリルアミド% (在庫 40% から)	ビサアクリルアミド%(2%ストックから)
0.6	3	0.045
3	5	0.075
10	10	0.075
20	8	0.195
70	10	0.45

結果

図1:さまざまな剛性の薄い2層蛍光ビーズ包埋ポリアクリルアミド(PA)ハイドロゲル上に存在する宿主細胞の細菌感染アッセイ。ガラスカバースリップは、ハイドロゲルの付着を可能にするために化学的に改変されています。3.6μLのPA混合物をガラス底に堆積させます。混合物は、重合を可能にするために12mmの円形ガラスカバーガラスで覆われています。カバースリップはニードルシリンジで取り外します。マイクロビーズ入りPA溶液2.4μLを最下層の上に加え、円形のガラスカバースリップで蓋をします。ウェルにバッファーを追加し、カバースリップを取り外します。 G.1時間のUV照射により、除菌を確実に行う...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
水酸化ナトリウムペレット	漁夫	S318-500
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン	シグマ	A3648
25%グルテルアルデヒド	シグマ	G6257-100ミリリットル
アクリルアミド 40%	シグマ	A4058-100ミリリットル
ビスアクリルアミド溶液(2%w / v)	フィッシャーサイエンティフィック	BP1404-250
フルオロスフェア カルボン酸修飾マイクロスフェア、0.1 μm、黄緑色蛍光灯 (505/515)	インビトゲン	F8803
過硫酸アンモニウム	漁夫	BP17925
テメド	シグマ	T9281-25ミリリットル
スルホサンパ	プロテオケム	C1111-100mg
コラーゲン、ラット由来I型溶液	シグマ	C3867-1VL
ジメチルスルホキシド(DMSO)	J.T.ベイカー	9224から01
HEPES、遊離酸	J.T.ベイカー	4018年04月
LeibovitzのL-15媒体、フェノール赤無し	サーモフィッシャー	21083027
MCDB 131 中、グルタミンなし	ライフテクノロジー	10372019
財団胎児ウシ血清、ロット:A37C48A	ジェミニバイオ製品	900108 500ml
上皮成長因子、EGF	シグマ	E9644
ヒドロコルチゾン	シグマ	H0888-J
L-グルタミン 200mM	漁夫	SH3003401
DPBSの1X	漁夫	SH30028FS
硫酸ゲンタマイシン	MPバイオメディカル	194530
クロランフェニコール	シグマ	C0378-5G
DifcoTM寒天、顆粒状	BDの	214530
BBL TMブレインハートインフュージョン	BDの	211059
Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物 - 水中の10 mg/ul溶液	インビトゲン	H3570-J
ホルムアルデヒド16%EMグレード	電子顕微鏡	15710-S
抗リステリア菌 monocytogenes 抗体	アブカム	AB35132
ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor® 546コンジュゲート	サーモフィッシャー	A-11035
0.25%トリプシンEDTA、フェノールレッド	サーモフィッシャー	25200056
CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC由来のコラゲナーゼ	シグマ	C8051
ストレプトマイシン硫酸塩	フィッシャーサイエンティフィック	3810*74-0
蔗糖	カルバイオケム	8510
ドデシル硫酸ナトリウム	サーモフィッシャー	28364
MESパウダー	シグマ	M3885
KClの	J.T.ベイカー	3040-05
MgCl2	J.T.ベイカー	2444-1
エグタ	アクロス	40991
使い捨てラボ機器
12mm円形ガラスカバースリップ	フィッシャーブランド	12-545-81	No. 1.5 カバースリップ | ガラス径10mm |コーティングなし
ガラス底部24ウェルプレート	マテック	P24G-1.5-13-F
5 mLポリスチレンチューブ、35 μmセルストレーナーキャップ付き	隼	352235
T-25フラスコ	隼	353118
50mlコニカルチューブ	隼	352070
15mlコニカルチューブ	隼	352196
ディスポーザブル血清ピペット(1 ml、2 ml、5 ml、10 ml、25 ml)	隼	357551
パスツールガラスピペット	VWRの	14672-380
ピペットチップ (1-200 μl, 101-1000 μl)	デンビル	P1122、P1126
パウダーフリー検査用手袋	マイクロフレックス	XC-310
キュベットバクテリア	ザルシュテット	67.746
カミソリ	VWRの	55411-050
シリンジ針	BDの	305167
0.2um滅菌ボトル	サーモサイエンティフィック	〒566-0020
20mlシリンジ	BDの	302830
0.2umフィルター	サーモサイエンティフィック	〒723-2520
木の棒	グレイン ジャー	42181501
サランラップ	サンタクルスバイオテクノロジー	SC-3687
プレートバクテリア	隼	351029
大型/使い捨て不可の実験装置
ティッシュカルチャーフード	パン屋	SG504
血球計算盤	シグマ	Z359629
バクテリアインキュベーター	サーモサイエンティフィック	IGS180
組織培養インキュベーター	ヌアイレ	NU-8700
真空チャンバー/デガッサー	ベラール	42025	37°Cおよび5%CO2
倒立型ニコンDiaphot 200落射蛍光顕微鏡	ニコン	ニコン-ダイアフォ-200
ケージインキュベーター	ハイソン	習慣
Scanford FACScan アナライザー	スタンフォード大学とCytek社がFACScanをアップグレード	習慣
ピペットエイド	ドラモンド	4-000-110
ピペッター(10μl、200μl、1000ul)	ギルソン	F144802、F123601、F123602
pHメーター	メトラー・トレド	30019028
鉗子	FSTの	11000から12
1Lフラスコ	フィッシャーブランド	FB5011000
オートクレーブマシン	アムスコ	3021
攪拌マグネットプレート	ベルコ	〒7760-06000
マグネット攪拌バー	ベルコ	1975-00100
分光 光度 計	ベックマン	DU 640
Scanford FACScan アナライザー	Cytek Biosciences(サイテックバイオサイエンス)	カスタムスタンフォードとCytekがアップグレードしたFACScan
ソフトウェア
顕微鏡ソフトウェア(μManager)	オープンイメージング
マトラブ	Matlab株式会社
フロージョ	FlowJo, LLC (合同会社
自動画像解析ソフトウェア「CellC」	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		ソフトウェアは無料で入手できます。E実行可能ファイルとMATLABソースコードは、次のURLから入手できます https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

の シリーズ 名 の さん の 年 年 )