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$$\longrightharp{xx}$$,
>1. マルチウェルプレート上での薄い2層ポリアクリルアミド(PA)ハイドロゲルの作製
- 過硫酸アンモニウム(APS)を蒸留超純水に溶解し、最終濃度10 g/mLにします。溶液を分注し、4°Cで保存して短期間(3週間)使用します。
注:上記の溶液は、ヒドロゲル製造に先立って調製することができます。
- 24ウェルディッシュのガラス活性化
- 直径13 mmのウェル(材料表を参照)を備えた24ウェルガラス底板を、ウェルあたり500 μLの2 M水酸化ナトリウム(NaOH)で室温で1時間インキュベー
トします。
- ウェルを超純水で1回すすぎ、次に500μLの2%(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(材料表を参照)を95%エタノールで各ウェルに5分間加えます。
- ウェルを水で再度1回すすぎ、各ウェルに0.5%グルタルアルデヒド500μLを30分間加えます。
- ポリアクリルアミドヒドロゲル製造
メモ: 図 1 を参照してください。
- 40%ストックアクリルアミド溶液(材料表を参照)の3〜10%と2%ストックビスアクリルアミド溶液(材料表を参照)の0.06〜0.6%を含む水溶液を調製して、0.6 kPa〜70 kPaの範囲の調整可能な剛性のヒドロゲルを製造します。表 1 を参照してください。
- 0.6 kPaのハイドロゲルの場合、3%アクリルアミドと0.045%ビスアクリルアミドを混合します。3 kPa ヒドロゲルの場合、5% アクリルアミドと 0.074% ビスアクリルアミドを混合します。10 kPa のヒドロゲルの場合、10% アクリルアミドと 0.075% ビスアクリルアミドを混合します。20 kPa のハイドロゲルの場合、8% アクリルアミドと 0.195% ビスアクリルアミドを混合します。70 kPa のハイドロゲルの場合、10% アクリルアミドと 0.45% ビスアクリルアミドを混合します。
注:望ましいPAハイドロゲル剛性の達成に関する詳細は、他の場所で見つけることができます。
- 必要なヒドロゲルの硬さごとに2つの水溶液を調製します。溶液 1 をビーズフリーにし、溶液 2 に直径 0.03% 0.1 μm の蛍光マイクロビーズを含有するように調製します (材料表を参照)。
- 溶液1および2を真空で15分間デガスし、溶液の重合を阻害することが知られている酸素を除去します。
- 10 g/mLストックAPS溶液の0.6%と0.43%テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を溶液1に加えて、重合開始を有効にします。迅速に行動する。
- 3.6 μLの溶液1を24ウェルディッシュの各ウェルの中央に加えます(調製についてはステップ1.2を参照)。
- 直ちにウェルを12 mmの未処理の円形カバースリップで覆い、溶液1を20分間放置して完全に重合させます。
- シリンジ針を表面に軽くたたいて、カバースリップの取り外しを容易にするために、その先端に小さなフックを作成します。シリンジ針を使用してカバースリップを持ち上げます。
- 溶液2に10 g/mLストックAPS溶液の0.6%と0.43%TEMEDを添加します。24ウェルディッシュの各ウェルの第1層の上に2.4μLの混合物を堆積させます。
- ソリューション2を12mmの円形ガラスカバースリップで覆い、一対の鉗子を使用して下にそっと押し下げ、2番目の層の厚さが最小限に抑えられるようにします。溶液2を20分間重合させます。
- 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) pH 7.5 を各ウェルに500 μL加え、シリンジ針と鉗子でガラスカバースリップをはがします。
- ポリアクリルアミドハイドロゲルの滅菌、コラーゲンコーティング、平衡化
- 組織培養フード内でハイドロゲルを1時間UV露光し、滅菌を可能にします。
- 0.5%重量/体積のスルホスクシンイミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(Sulfo-SANPAH、材料の表を参照)の混合物を1%ジメチルスルホキシド(DMSO)および50 mM HEPES pH = 7.5で調製します。
- この溶液200μLをハイドロゲルの上面に加えます。迅速に行動し、UV(302 nm)に10分間さらして活性化します。
- ヒドロゲルを1 mLの50 mM HEPES pH = 7.5で2回洗浄します。必要に応じて繰り返して、余分な架橋剤が除去されていることを確認します。
- ハイドロゲルを200 μLの0.25 mg/mLラットテールコラーゲンI(材料表を参照)で50 mMのHEPESにタンパク質コーティングします。コラーゲン溶液を上にして、ハイドロゲルを室温で一晩インキュベートします
注:脱水/蒸発を防ぐために、マルチウェルプレートを二次格納容器に置き、格納容器の内周に水に浸した実験室洗浄組織を追加します。
- 40倍対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、ハイドロゲルの厚さを測定します。これを行うには、ヒドロゲルの底面(ガラス面がある場所)と上面(蛍光ビーズの強度が最大)のz位置を特定します。次に、z 位置を減算して高さを求めます。
注:倒立脱射蛍光顕微鏡と開口数0.65の40倍対物レンズを使用して、ハイドロゲルの厚さを測定しました。この時点で原子間力顕微鏡(AFM)測定も実行して、ハイドロゲルの正確な剛性を確認することもできます(図2を参照)。
- 目的の細胞をハイドロゲルに播種する前に、ハイドロゲル上に1 mLの培地を加え、37°Cで30分間から1時間インキュベートして平衡を確保します
注:MCDB-131フル培地は、モデル宿主細胞(HMEC-1)が培養された培地であるため、追加しました(詳細についてはステップ2.1を参照)。
2. ヒト微小血管内皮細胞の培養とハイドロゲルへの播種
- 10% ウシ胎児血清、10 ng/mL の上皮成長因子、1 μg/mL のヒドロコルチゾン、および 2 mM の L-グルタミンを添加した MCDB-131 培地を含む MCDB-131 フル培地で HMEC-1 (ヒト、微小血管内皮) 細胞を培養します (材料の表を参照)。
- コンフルエント培養物を3〜4日ごとに1:6に分割し、細胞を継代40まで保持します。
- 実験の1日前に、0.25%トリプシン/EDTAを使用して細胞を培養容器から切り離します。まず、細胞とその培養容器を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、次に適切な量の0.25%トリプシン/EDTA(100 mmディッシュまたは75 cmフラスコあたり2 mL、60 mmディッシュまたは25 cmフラスコあたり1 mL)を加え、フラスコを37°Cで5〜10分間インキュベートして、細胞を基質から剥離させます。
- 所望の量のMCDB-131フル培地を加えてトリプシンを中和し、ピペットで静かに細胞の塊を砕き、溶液を円錐形の遠心分離チューブに入れます。
- 細胞の溶液を静かに渦巻いて細胞が均一に分布していることを確認してから、20μLの溶液を取り出し、ガラス血球計算盤のカバーガラスの下にある2つのチャンバーに非常に静かに充填します。
- 円錐形遠心チューブに含まれる細胞の溶液を、500 x gで10分間遠心分離してペレット化します。
- 10分間の待機期間中に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。顕微鏡を使用し、10倍対物レンズで血球計算盤のグリッド線に焦点を合わせ、ハンドタリーカウンターを使用して1 mm x 1 mmの正方形の細胞数をカウントします。
- 血球計算盤を別の1 mm x 1 mmの正方形に移動し、そこで細胞を数え、さらに2回プロセスを繰り返します。4 つの測定値の平均を計算し、その平均に 104 を掛けます。最終的な値は、遠心分離される細胞懸濁液中の生細胞数/mLです。
- 円錐形の遠心分離チューブから液体を取り出し、細胞ペレットが破壊されないようにします。MCDB-131フル培地中の細胞を4 x 105細胞/mLの濃度で再懸濁します。
- まず、ハイドロゲルをインキュベートした培地を除去し、次に各ハイドロゲルに1 mLの細胞懸濁液を添加することにより、ハイドロゲル上に懸濁液中の細胞を播種します。
>3. ヒト微小血管内皮細胞のリステリア菌(Lm)の感染
- 事前準備
注意: 事前に次の解決策を準備してください。
- ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシンのストック
- ストレプトマイシンストック溶液50mg/mLを調製するには、硫酸ストレプトマイシン0.5gを秤量し、超純水10mLに完全溶解します。
- 75 mgのクロラムフェニコールを秤量し、100%エタノール10 mLに完全に溶解することにより、7.5 mg / mLのクロラムフェニコールストック溶液を調製します。.
ゲン- タマイシン原液20 mg/mLを調製するには、0.2 gの硫酸ゲンタマイシンを秤量し、10 mLの超純水に完全溶解します。
- すべてのストック溶液を0.2μmシリンジフィルターでフィルター滅菌し、長期使用(1〜2か月)のために-20°Cで保存します。
- 脳心球注入(BHI)培地と寒天プレート
- 2つの1-Lフラスコを見つけ、各フラスコ内にマグネチックスターバーを追加します。
- BHI培地は、1つのフラスコにBHI粉末37gを加え、1Lまでの超純水を加え、フラスコを磁気攪拌板に載せて粉末が溶解するまで激しく混合します。
- BHI寒天プレートの場合は、2番目のフラスコに37 gのBHI粉末と15 gの粒状寒天(材料表を参照)を加え、1 Lまでの超純水を加えます。
- フラスコの蓋をきつく締めすぎないようにねじ込み、液体設定またはオートクレーブの仕様に従って溶液をオートクレーブします。
- 溶液をオートクレーブから取り出し、寒天BHI溶液を55°Cに冷却します。1Lフラスコ内のBHI培地を無菌状態にしておくと、最大1ヶ月間使用できます。
- 細菌寒天BHIプレートを調製するには、まず、必要に応じて、BHIと寒天を含むフラスコに抗生物質を追加します(増殖する細菌株によって異なります)。フラスコをマグネティックスタープレートに軽く置き、すばやく混合できるようにします。
注:ここで使用される抗生物質は、使用されるLm株に特異的ですが、BHI寒天プレートには必要な抗生物質を使用することができます。10403S Lm株がストレプトマイシンに耐性があるため、ストレプトマイシンを200μg/mLの濃度に、クロラムフェニコールを7.5μg/mLの濃度に添加しました。これらの株は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼオープンリーディングフレームを含むプラスミドと結合されているため、クロラムフェニコールに対する耐性があります。
- 混合物を10cmのポリスチレンバクテリア培養プレート(プレートあたり約20mL)に注ぎます。気泡を取り除くには、プレートの上面を短時間炎で焼きます。プレートを室温で一晩冷やします。
- 翌日、乾板を密封し、4°Cで保存します。
- ヒト微小血管内皮細胞へのL. monocytogenesの感染
- 感染の3日前に、グリセロールストック(-80°Cで保存)から使用するLm株を、必要に応じて7.5μg/ mLのクロラムフェニコールと200μg/ mLのストレプトマイシンを含むBHI寒天プレートにストリークアウトします。
注:ストリークアウトされる株は、野生型または変異体であり得、構成的に蛍光を発現する(免疫染色のためにJAT1045を用いた)またはActAプロモーターの下で蛍光を発現する(フローサイトメトリーまたは牽引力顕微鏡のためにJAT983またはJAT985を用いた)。
- プレートを37°Cでインキュベートし、個別のコロニーが形成されるまで(1〜2日)します。
- 感染の前日に、目的の菌株を一晩成長させ、BHI培地で30°Cで150rpmで振とうし、7.5μg/mLのクロラムフェニコール(適切な場合)を加えます。
- 5 mLのBHI培地を15 mLのコニカル遠心チューブに入れ、7.5 μg/mLのクロラムフェニコール(適切な場合)を添加し、滅菌済みの10 μLチップを使用して寒天プレートから1つのコロニーを接種します。
- 翌日、感染の直前に、サンプルを1:5に希釈して、600 nm(OD600)の細菌溶液の光学密度を測定します。BHIのみを含んだキュベットをブランクとして使用します。
- 一晩培養した培地をOD600を0.1に希釈し、BHI培地で30°Cで2時間振とうしながら、7.5 μg/mLのクロラムフェニコール(適切な場合)とインキュベートして、細菌が対数期の増殖に達するまで待ちます。
- 細菌溶液のOD600を測定し、これは約0.2〜0.3であると予想されます。OD600の方が高い場合は、BHIのみで0.2〜0.3に希釈します。
- 1mLの細菌溶液を微量遠心チューブに入れます。室温で遠心分離を行い、2,000 x gで4分間スピンダウンします。上清を取り除き、組織培養フード内の組織培養グレードのPBS1 mLに細菌ペレットを再懸濁します。バクテリアを室温で2,000 x gで4分間スピンダウンして、さらに2回洗浄します。上清を取り除き、細菌を1mLのPBSに再懸濁します。
- PBSに再懸濁した細菌10または50 μLを1 mLのMCDB-131フル培地と混合して、感染ミックスを調製し、感染の多様性(MOI;すなわち、宿主細胞当たりの細菌数)は、宿主細胞当たり約50個の細菌、または宿主細胞当たり10個の細菌である。
- 24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、ハイドロゲルや細胞を破壊しないように注意します。1 mLのMCDB-131フル培地で細胞を1回洗浄し、次に1 mLの細菌を各ウェルに加えます。
- MOIの測定のために、感染ミックス(少なくとも100μL)を保管してください(ステップ3.3を参照)。
- プレートを蓋で覆い、漏れを防ぐためにプレートをポリエチレン製の食品ラップで包みます。プレートを遠心分離機に置き、サンプルを200 x gで10分間回転させて、浸潤を同期させます。プレートを組織培養インキュベーターに移し、37°Cで30分間インキュベー
トします。
- サンプルをMCDB-131フルメディアで4回洗浄し、組織培養インキュベーターに移します。さらに30分後、培地を20 μg/mLのゲンタマイシンを補充した培地と交換します。
- 感染の多様性(MOI)の決定
- 宿主細胞と細菌の最初の30分間のインキュベーション中に、感染混合物の10倍段階希釈液を調製してMOIを決定します。100 μLの感染ミックスと900 μLの1x PBS(10-1希釈)を混合して、10倍希釈します。次に、10-1希釈液100μLとPBS900μL(10-2希釈液)を混合します。
- 10-5希釈が得られるまで続けます.
注:すべての溶液は、希釈する前に十分に混合する必要があり、各ステップで新鮮で清潔なピペットチップを使用する必要があります。
- 希釈したら、10-2 - 10-5希釈液のうち100 μLをBHI/寒天/クロラムフェニコール/ストレプトマイシンプレート(該当する場合)の中央に置きます。
- ガラスピペットからスプレッダーを作るには、火を使ってピペットを曲げてフックを作ります。ピペットを100%エタノールに浸して滅菌し、エタノールを炎で焼き払います。
- スプレッダーが冷えたら、細菌の希釈液をプレート上に均一に広げ、10-5の希釈から始めて、より濃縮された混合物に移動します。プレートを逆さまにして37°Cで2日間インキュベートします。
- コロニー密度に応じて、10-3と10-4、または10-4と10-5の希釈プレートのいずれかのコロニー数を決定します。MOI は次のように計算します:
コロニー数×希釈係数÷初期添加量=μLあたりのコロニー形成単位(CFU)の数
μLあたりのCFU数×ウェルあたりのバクテリアミックスの量=ウェルあたりのCFU数
ウェルあたりのCFUの数×ウェルあたりの細胞量=細胞あたりの細菌の数
注:CFUはコロニー形成ユニットの略です。
- 2 つのプレートの MOI を平均化して、最終的な MOI を求めます。
>4. 細胞外マトリックス剛性を評価するための定量的タイムラプス顕微鏡
法
PAハイドロゲルを24ウェルプレート上に調製し(ステップ1を参照)、HMEC-1細胞をシードし(ステップ2を参照)、上記のようにJAT983培養を一晩で増殖させます(ステップ3を参照)。
- 感染日には、MCDB-131フル培地1mLあたり10μLの細菌ペレットを混合して感染ミックスを調製します。24ウェルプレートのウェルから培地を慎重に取り出し、MCDB-131フル培地1.9 mLと細菌ミックス0.1 mLを各ウェルに加えます
注:このアッセイで使用される低いMOIは、宿主細胞に侵入する単一の細菌から始まる播種イベントの解析に必要です。
- プレートを蓋で覆い、漏れを防ぐためにラップで密封します。プレートを遠心分離機に置き、サンプルを200 x gで10分間回転させて、浸潤を同期させます。
- プレートを組織培養インキュベーターに移し、5分間インキュベートします。
- サンプルを培地で4回洗浄し、組織培養インキュベーターに移します。さらに5〜7分後、培地を20μg/mLのゲンタマイシンを補充した培地と交換します。
- インキュベーター内でプレートをさらに5時間インキュベートして、actAプロモーターがオンになり、mTagRFPオープンリーディングフレームの発現を駆動できるようにします。
- Leibovitz の L-15 に 10% ウシ胎児血清、10 ng/mL の上皮成長因子、および 1 μg/mL ヒドロコルチゾンを添加して、生顕微鏡培地を調製します
注:L-15にはすでに2 mM L-グルタミンが含まれているため、MCDB-131メディアのように追加する必要はありません。
- 1 μL の 1 mg/mL Hoechst 色素と 1 mL の L-15 フル培地を混合し、各ウェルに加えて細胞の核を染色します。細胞を組織培養インキュベーターに10分間置いた後、各ウェルでL-15フル培地を1 mLのL-15フル培地に20 μg/mLのゲンタマイシンを補充して交換します。プレートを蓋で覆い、37°Cに平衡化した顕微鏡の環境チャンバー(材料の表を参照)に置きます
注:イメージングには、CCDカメラ(材料の表を参照)と0.75 NAの20倍エアプラン蛍石対物レンズを備えた倒立落射蛍光顕微鏡を使用しました。出力は50%、露光時間は50msに設定しました。mCherryに使用される顕微鏡フィルターは、励起用と発光用がそれぞれ470/525 nmです。
- オートフォーカス機能を使用して5分ごとに複数の位置を画像化し、さまざまな剛性のハイドロゲルに播種されたHMEC-1単分子膜を介してLmがどのように広がるかを監視します
注:L-15はHEPESで緩衝されているため、イメージング中にCO2を使用する必要はありません。
>表 1.さまざまな剛性のポリアクリルアミド (PA) ハイドロゲルの組成。この表では、所定の剛性 (ヤング率、E) を達成するための 40% アクリルアミド溶液のストックの割合と 2% ビスアクリルアミド溶液のストックの割合を異なる列に示しています。
名
名
名
名
名
名
| ヤング率(E、kPa) | アクリルアミド% (在庫 40% から) | ビサアクリルアミド%(2%ストックから) |
| 0.6 | 3 | 0.045 |
| 3 | 5 | 0.075 |
| 10 | 10 | 0.075 |
| 20 | 8 | 0.195 |
| 70 | 10 | 0.45 |
