プラークアッセイによる治験薬の抗ウイルス効果の判断

要約

出典:Yadavalli, T., et al.単純ヘルペスウイルス-1抗ウイルス薬の有効性を研究するためのブタ角膜組織外植片。J. Vis. Exp.(2021年)

この動画では、感染した豚角膜から採取したウイルスを用いてプラークアッセイを行う方法を実演しています。ブタの角膜は、実験薬の抗ウイルス効果をテストするために使用されます。

プロトコル

1. ウイルス感染の定量化

>注:豚角膜からのウイルス力価は、薬物治療の効果を分析するために毎日評価する必要があります。

1. ウイルスを定量するには、この実験で行ったように、6ウェルプレートを使用する場合、ウェルあたり5 x 10⁵の細胞の密度でVero細胞を播種します。これは感染の前日に行ってください。播種した細胞を一晩インキュベートして、ウイルス定量のためにコンフルエントであることを確認します。
2. 500 μLの無血清培地を複数の微量遠心チューブに分注します。滅菌綿の先端を綿棒で、無血清の培地で満たされたチューブに浸します。.綿棒は、使用前に少なくとも5分間浸して濡らす必要があります。
3. 下層の培地を乱さずに、感染したブタの角膜プレートをバイオセーフティキャビネットに輸送します。濡れた綿棒を使用して、感染したブタ角膜の中心から直径5mmで時計回りに3回転、反時計回りに3回転させます。
4. 綿棒を無血清培地入りのマイクロ遠心チューブに戻し、時計回りと反時計回りに5回回転させます。綿棒の金属チップは、マイクロ遠心チューブに完全に収まり、蓋を閉じることができるように短くカットする必要があります。
5. 綿棒で拭いた綿先が入った微量遠心チューブをボルテックスマシンに置き、高速で1分間ボルテックスします。
6. これらのサンプルに対してプラークアッセイによるウイルス定量を行います.
   手記： この定量ステップは、感染後2日目、4日目、およびオプションで6日目に実行する必要があります。

2. プラークアッセイによるウイルス定量

>注:プラークアッセイを実行するには、Vero細胞を成長させて6ウェルプレートにプレートし、アッセイを開始する前に細胞の90%のコンフルエンシーを確保します。これらの細胞のコンフルエントな^75cm2フラスコを使用します。以下のすべての手順は、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。

1. 培地を吸引した後、フラスコ内のVero細胞のコンフルエント単層を10 mLの新鮮なリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。最初の洗浄液セットを吸引した後、PBSで洗浄ステップをもう一度繰り返します。
2. 0.05%トリプシン1mLを細胞単層に加えます。フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。肉眼で、細胞がフラスコの内面から剥がれていることを確認します。そうでない場合は、さらに5分待ってから、フラスコを再度調べてください。細胞が剥離したように見える場合は、9 mLの全培地を単層に加えて、細胞がフラスコ表面から完全に剥がれるようにします。
3. フラスコからすべての細胞を培地全体とともに収集し、15 mLの遠心チューブに入れます。
4. プラークアッセイに使用される6ウェルプレートのウェルごとに、遠心チューブから300μLを使用します。6ウェルプレートの各ウェルに2 mLの全培地を補充します。プレートをインキュベーターに一晩置いて、プレートが成長し、各ウェルでコンフルエントな単層を形成するようにします。
5. プラークアッセイを実施するためには、ウイルスの定量前にサンプルの段階希釈を実施する必要があります。
6. 無血清培地を使用して、マイクロ遠心チューブでウイルスのlog101倍希釈を行い、希釈度が^10-8に達するまで行います。^10-3希釈で、6ウェルプレートから細胞上の増殖培地を吸引した後、希釈液1 mLをプレーティング細胞の単層に移すと、これが感染ステップになります。感染したプレートを37°Cのインキュベーターで2時間インキュベートします。
7. 既存の感染培地を吸引し、PBSで2回穏やかに洗浄して細胞をコーティングし、ウェルごとに2 mLのメチルセルロース含有培地を6つのウェルすべてに加えます。72時間またはプラークの形成が見られるまでインキュベートします。プラークは、細胞単層の細胞間に小さな隙間が形成されることによって識別できます。
8. 壁をガイドチップとして使用して、各ウェルの角に1 mLのメタノールをゆっくりと加えます。6ウェルプレートを室温で15分間インキュベートします。各ウェルの内容物をプレートからゆっくりと吸引し、細胞単層を乱したり攪拌したりすることはありません。
9. 1 mLのクリスタルバイオレットワーキング溶液を6ウェルプレートの各ウェルに添加し、すべての細胞が覆われていることを確認します。6ウェルプレートを暗所で30分間インキュベートします。クリスタルバイオレット溶液を吸引して廃棄し、吸収紙のシートでウェルを乾燥させます。
10. 最も希釈度の高いウェルでプラークの数をカウントし、開始溶液中のウイルス含有量の合計を定量化します。このプロセスを2回繰り返して、ウイルス力価を確認します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
30 gの皮下注射針。	BDの	305128
500mLのガラス瓶。	トーマス・サイエンティフィック	844027
バイオセーフティレベル2(BSL-2)認証を取得したバイオセーフティキャビネット。	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ヘラセーフ2030i
カルギスワブ6 "滅菌アルギン酸カルシウム標準綿棒。	ピューリタン	22029501
セルスクレーパー - 25 cm	バイオロジックスBE	70-1180 70-1250
遠心分離管
クリスタルバイオレット	シグマ・アルドリッチ	C6158	粉末は暗い場所に保管してください
ダルベッコの改造イーグルの媒体 - DMEM	ギブコ	41966029	使用するまで4°Cで保存
エタノール	シグマ・アルドリッチ	E7023
ウシ胎児血清 -FBS	シグマ・アルドリッチ	F2442	50mLのチューブに分注し、使用するまで冷凍保存します
ベロ細胞	アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC	CRL-1586
ボルテックスマシン
メタノール
メチルセルロース
マイクロ遠心チューブ
ブタ角膜	Park Packaging Co.、イリノイ州シカゴ		リクエストによる特別注文
手順ベンチカバー - 必要に応じて。	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S42400
セロロジカルピペット	トーマス・サイエンティフィック	P7132、P7127、P7128、P7129、P7137
セロロジカルピペッティング装置。	トーマス・サイエンティフィック	エズペットプロ
実体鏡	カールツァイス	SteREOディスカバリーV20
組織培養フラスコ、T175 cm2。	トーマス・サイエンティフィック	T1275
5% CO2、37°Cの温度を維持できる組織培養インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	フォーマ50145523
組織培養処理プレート(6ウェル)。	トーマス・サイエンティフィック	T1006
トリプシン

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