ウイルス感染細胞における多微生物バイオフィルムの開始を決定するためのアッセイ

要約

出典:Plotkin, B. J. et al., Determination of Biofilm Initiation on Virus-Infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、細菌や真菌によるウイルス感染細胞への多微生物バイオフィルム形成の開始を示しています。単純ヘルペスウイルス感染は、細胞への細菌の付着を妨げ、細菌と真菌の共局在を防ぎます。対照的に、感染していない細胞は、細菌と真菌の共局在とバイオフィルム形成の開始を示します。

プロトコル

1. HSVの系統と取り扱い

>注:アッセイには、β-ガラクトシダーゼレポーター活性を持つ組換え非拡散HSV-1(KOS)gL86およびHSV-2(KOS)333gJ^-を使用します。

1. 1ロットのウイルスを使用し、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と20%ウシ胎児血清(FBS)およびスキムミルクを1:1の比率で-80°Cで保存します。ウイルスロットを保存する前に、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)アッセイによりウイルス濃度を測定してください。
2. 前述のように、レポーターウイルスエントリーアッセイを使用して、各実験アッセイのX-Gal染色により、ウイルスの生存率と感染の多様性(MOI)を決定します(図1)。
3. ウイルス(Opt-MEM)を所望のMOIに希釈します。染色前に単層(パラホルムアルデヒド;0.5 ml/well)を固定します。ウイルス生存率コントロールは、ポリマイクロビカルアッセイプレートと並行して別のマイクロタイタープレートに入れます。

2. HeLa 299 セルの取り扱い

1. 4.5 g/Lグルコース、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、ゲンタマイシン(50 μg/ml)、およびL-グルタミンを含むDMEM中、37°C、5% CO₂で増殖します。トリプシン溶液(エチレンジアミン四酢酸、0.53 M EDTA、0.05%トリプシン、5 mL/フラスコ)と80%コンフルエントする継代細胞。

3. C. albicansの取り扱い

>注:臨床検査源から得られたC.アルビカンスは、Remmel skim milk 2x mediumで-80°Cで保存されています。

1. 凍結ストックをSabouraud Dextrose Medium(37°C)で培養します。24時間後に、C.アルビカンスをFungisel培地(37°C;48時間)に継代培養して使用します。
2. 生殖管(GT)フォームを生成します(代表的なコロニーを選択、3 ml FBS、3時間、37°C、吸光度₆₀₀(Abs₆₀₀)、0.3)。インキュベーション後、GT(ハンクス平衡塩溶液、HBSS;2x;4,000 x g)を洗浄します。温めたHBSS(37°C;0.32 Abs₆₀₀)に洗浄したGTを加えます。GT型は、血球計算盤の数によって決定される観察された細胞の99%である必要があります。
3. 代表的な真菌コロニー(HBSS、3 ml、0.32 Abs₆₀₀)を選択することにより、酵母型(YF)ストック懸濁液を作成します。血球計算盤を使用して、YFフォーム/ mlの数を顕微鏡でカウントします。YF形態は、血球計算盤の数によって決定される観察された細胞の99%でなければなりません。
4. 作業用真菌ストック(250 μlのGTまたはYFストックを25 ml HBSS、37 °C、10⁵コロニー形成ユニット、(CFU/ml)に添加します。

4. 黄色ブドウ球菌の取り扱い

1. ストア S. aureus American Type Culture Collection, ATCC 25923 (-80 °C;Remmel skim milk 2x)。羊の血液寒天培地(5%、37°C、24時間)で培養します。代表的なコロニーを選び、2日以内にマンニトール塩培地に移してストックします(37°C;18時間)。
2. 黄色ブドウ球菌のストック懸濁液(3 ml HBSS; 1.32 Abs_{600 ;}10⁸ CFU / ml)
   1. 黄色ブドウ球菌のストックを100 μl、25 ml HBSSに10 μl、⁵ CFU/mlで作業用ストックを調製します。

>5. カンジダと黄色ブドウ球菌の懸濁液

1. C. albicansと黄色ブドウ球菌の懸濁液を混合します (250 μl の YF または GT ストックと 100 μl の黄色ブドウ球菌ストックを 25 ml HBSS に入れます)。

6. ポリマイクロバイオフィルムアッセイ

1. 200 μl の 2 x 10⁵ HeLa 細胞/mL (85% コンフルエンスレベル) を含む 96 ウェルプレートをシードします。インキュベーション前(37°C、5%CO₂インキュベーター、18時間)のロックプレート(30〜45分、37°C)。単層を洗浄します(1x;Opt-MEM)をシードし、HSV(HSV-1(KOS)gL86またはHSV-2(KOS)33 gJ^-を100μlのOpt-MEMに播種します。MOI 50および10)。プレートをインキュベートします(3時間、37°C、5%CO₂)。1日1種類のウイルス株のみを使用してください。
2. 感染した単分子膜(1x、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をMg⁺²およびCa⁺²、100μl)で洗浄します。PBSを温かいHBSSに交換し、各ウェルに25μlを残します。
   1. 表1に示すように、YF、GTおよび/または黄色ブドウ球菌のワーキングサスペンション(100 μl、ターゲットと細胞の比率=5:1、n=16)を添加します。プレートをインキュベートします(静的、30分、37°C、5%CO₂)。
3. インキュベーション後、一度に1カラムずつ吸引し、すぐにMg⁺²およびCa⁺²を含むPBS300μlを補充します。このステップを2回繰り返してから、ラジオ免疫沈降アッセイ溶解バッファー(RIPA、フィルター滅菌済み、1:50希釈液200μl)を添加します。
4. HeLa細胞ライセートを迅速に粉砕し、50 μlをマンニトール塩(MS)および/または真菌(F)培地(図2)上に置きます。90°の角度に曲げたガラス棒を使用してライセートを広げます。プレートをインキュベートします(37°Cで18時間)。プレートあたりのコロニー数を手動でカウントします。コントロールは、黄色ブドウ球菌および/またはC.アルビカンスがHSVに感染していないHeLa細胞を付着させることで構成されています。

>表 1.ポリ微生物相互作用における微生物付着の一般的なテンプレート測定。GT=カンジダ・アルビカンス胚芽管表現型;YF= C.アルビカンス酵母は表現型を形成します。MSSA=メチシリン感受性黄色ブドウ球菌;MS =マンニトール塩中;F =菌類媒体。

結果

図 1.X-gal Staining Pictures of Dosage Dependent HSV-1 Infection in HeLa cells. HSV-1 に感染した HELA 細胞をさまざまな MOI で染色し、X-gal を染色した。(A)X-Gal染色された模擬感染HeLa細胞制御を備えた96ウェルプレートのウェル中のHeLa細胞。20倍の初期倍率。(B)HSV-1に感染したX-Gal染色HeLa細胞を10の感染多重度(MOI)でX-Gal染色した96ウェルプレートのウェル中のHeLa細胞。20倍の初期倍率。(C)HSV-1に感染したX-Gal染色HeLa細胞を50の感染多重度(MOI)でX-Gal染色した96ウェルプレートのウェル中のHeLa細胞。20倍の初期倍率。スケール...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C.アルビカンス
BBLサブローデキストロース	BDの	211584
菌類寒天	ドットサイエンティフィック	7205Aの
黄色ブドウ球菌
マンニトール塩寒天	トロイバイオロジカルズ	7143Bさん
羊の血液寒天培	トロイバイオロジカルズ	221239
Hela細胞
1xDMEM(デュベルコのモディファイドイーグルミディアム、4.5 g / LグルコースとL-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムなし)	コーニング	10-017-CM
ゲンタマイシン50mg / ml	シグマ	1397	完全なDMEM中の50μg/mlの最終濃度
トリプシンEDTA(0.05%トリプシン、0.53M EDTA)溶液1X	コーニング	25-052-CIの
ウシ胎児血清	アトランタバイオロジカルズ	S11150	完全なDMEM中の10%の最終濃度
その他の培地および試薬
ONPG	サーモサイエンティフィック	34055
ウルトラピュアXギャル	インビトゲン	15520-018
1x HBSS(ハンクス平衡塩溶液)	コーニング	20-021-履歴書
1XPBSの	ドットサイエンティフィック	30042-500
RIPAリシス	ライフテクノロジー	89901
調度
96ウェルプレート	エバーグリーン・サイエンティフィック	〒222-8030-01F
培養チューブ 100x13	トーマス・サイエンティフィック	9187L61

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