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1. ソリューションとメディア
- 表1に従って、2X Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Sabouraudデキストロースブロス、およびSabouraudデキストロース寒天培地を準備します。
2. 真菌の増殖条件
- すべての真菌株は、必要になるまで、-80°Cで35%グリセロール中の凍結ストックとして保存してください。
- 各実験の前に、次の手順を実行します。
- カンジダ・アルビカンス株の場合:
- ストックバイアルを解凍し、キャップ付きの滅菌済み50 mLポリプロピレンチューブに200 μLを10 mLのSabouraudデキストロースブロスに移し、攪拌しながら30°C(200 rpm)で一晩培養します。チューブを傾け、キャップを少し開いたままにして、培養物の通気性を向上させることを忘れないでください。
- Cryptococcus neoformans株の場合:
- ストックバイアルの凍結面をこすり落とします。細胞をSabouraudデキストロース寒天プレートにプレートし、30°Cで48時間インキュベートします。単離されたコロニーが目に見える成長を遂げた後、プレートをパラフィンフィルムで密封した冷蔵庫(4°C)で最大15日間保管します。
- 滅菌爪楊枝または滅菌接種ループを使用してプレートから中型の分離コロニーを採取し、滅菌50mLのコニカルチューブに10mLのSabouraudデキストロースブロスを接種します。撹拌下(200 rpm)で30°Cで約24時間インキュベートします。
- 24時間のインキュベーションを超えないようにしてください。チューブを傾け、キャップを少し開いたままにして、通気を改善することを忘れないでください。これは抗菌薬耐性に影響を与える重要な要素であるため、各テストの前に細胞の成長段階を標準化することは常に良いことです.
手記：私たちの実験では、どちらの菌類も迅速な増殖のために30°Cで増殖しましたが、臨床治療(37°C)など、研究の目的を反映して温度を変更することができます。最も重要なことは、この初期インキュベーション時間は、各真菌分離物について事前に確立し、再現性を確保するためにすべての試験を通じて維持する必要があります。
- 真菌の増殖後、コニカルチューブを1,200 x gで室温で5分間遠心分離して細胞を回収します。上清を捨て、PBSを10mL加えます。
- 細胞を再懸濁し、室温で1,200 x gで5分間再度遠心分離します。
- PBS洗浄と遠心分離をさらに2回繰り返します。3回目の洗浄後、2X RPMI-1640培地の5 mL(ペレットサイズによる)に細胞を再懸濁します。
- 1:100または1:1,000の希釈液を1 mLを微量遠心チューブで調製します(細胞懸濁液の濁度によって異なります)。
- この希釈液を10μL分量し、血球計算盤チャンバーに入れ、顕微鏡下の4隅の象限の細胞の総数をカウントします。(総細胞数/4)×希釈係数×104(チャンバー希釈定数)の式で濃度を計算します。
- 研究対象の分離株について生存率カウントと増殖条件が体系的に相関している場合、生存率は100%と考えてください。
手記： 生存率カウントの標準化と品質管理は、酵母の欧州抗菌剤感受性試験委員会(EUCAST)の抗真菌最小阻害濃度(MIC)法に従ってバックプレーティングを行うことで行うことができます。
- 研究中の単離物について増殖/生存率の相関関係が確立されていない場合は、フロキシン B11、トリパンブルー、ヤヌスグリーンなどの死細胞を選択的に着色する色素を使用して、血球計算盤で生細胞をカウントすることにより、真菌の生存率を測定します。このプロトコルでは、この時点での集団の生存率が 90% 以上の場合にのみ、真菌細胞を使用してください。
注:死んだ/生きている染料は、選択した真菌とうまく機能しない場合があります。ご使用前にテストしてください。例えば、トリパンブルー色素はC.neoformansにはうまく機能しません。
- その後、2X RPMI-1640培地(RPMI-1640培地中の2X調整接種)で細胞懸濁液を調製します。96ウェルプレートの場合、各プレートの容量を5 mLとしてください。
- すべてのC. albicans株について、4 x 103細胞/mLのストック細胞懸濁液を調製します。この濃度は、各ウェルの最終細胞濃度(2 x 103細胞/mL)の2倍です。
- C. neoformans株の場合は、細胞2 x 104細胞/mLのストック培養液を調製します。この濃度は、各ウェルの最終細胞濃度(1 x 104細胞/mL)の2倍です。
- 他の真菌については、インキュベーション時間に関連して特定の研究に理想的な濃度が既知の抗真菌剤でテストします。真菌の代謝と重複時間を考慮に入れてください。
3. ペプチド(不明物質)
- 凍結乾燥ペプチドを-20°Cで保存し、各実験の前に脱イオン水に溶解してください。水に溶解した後の最大保存時間は、各ペプチドの性質によって異なります。
- アッセイで試験した最高最終濃度の2倍(2倍)のアリコートを調製します。理想的には、凍結融解サイクルを避けるために、1回の使用に十分なペプチドを含む少数のアリコートを調製します。
手記：濃度の選択は、文献とペプチドの特性に基づいて行う必要があります。約100 μMのペプチドで段階希釈を開始し、得られた結果に応じてこの濃度範囲を増減することをお勧めします。
4. 参考になる抗真菌薬(ポジティブコントロール)
- 水で希釈したものの場合:分析の最高濃度の2倍溶液を調製します(希釈ステップについては、セクション5:抗真菌アッセイを参照)。
- C. albicans株の場合は、128 μg/mLのフルコナゾールまたは128 μg/mLのカスポファンギンの溶液を調製します。両方のプレート濃度は 64 μg/mL になります。
- C. neoformans株の場合は、32 μg/mLのアムホテリシンB(水溶性溶液)の溶液を調製します。プレート濃度は16μg/mL
となります。
注:通常、アンホテリシンBはジメチルスルホキシド(DMSO)で希釈されますが、これはこの抗真菌剤が水に溶けにくいためです。ただし、水溶性のアムホテリシンB製剤が市販されています。
- 有機溶媒で希釈した抗真菌剤の場合:DMSOで100倍のストック溶液を準備し、次にそれを水で10倍に希釈して使用します
手記： したがって、井戸内では、DMSOの最終濃度は1%を超えません。一部の菌類がこの濃度の溶媒に十分に耐えられないことを考えると、制御として1%DMSOを含む培地で真菌が増殖する井戸。DMSOは感光性があるため、インキュベーション期間中はプレートをホイルで覆うか、暗いチャンバーに入れてください。
5. 抗真菌アッセイ
>注:In vitro抗真菌アッセイは、Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)のM27-A3ガイドラインのブロス微量希釈感受性試験に基づいて実施されます。
- 各ペプチドを2倍段階希釈し、96ウェルポリスチレンマイクロプレートの抗真菌剤を最終容量50 μLに制御します。
- ピペットを使用して、100 μLの抗真菌剤/ペプチドを、行Aの列1〜3に所望する最高最終濃度の2倍の濃度で添加します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、50 μLの滅菌水を他のウェル(列BからH)に加えます。
- 最高濃度のウェル(行A)の50μLを取り出し、次の濃度の次のウェル(行B)に移して均質化します。
- 最も濃度の低いウェルまで上記の手順を繰り返し、このウェル(行H)の50μLを廃棄します。列 11 と 12 (行 A、B、C) には、空白のコントロールまたはネガティブ/グロース コントロールの水のみを残します。
- RPMI-1640培地中の2倍調整済み接種物50 μLを各ウェル(カラム1-3およびカラム11(ネガティブ/増殖コントロール))に加えると、C. albicansの最終濃度は2 x 103細胞/mL、C. neoformans株の最終濃度は104細胞/mLになります。
- ブランクコントロール(50 μLの水 + 50 μL 2X RPMI-1640培地(細胞なし))とネガティブ/グローコントロール(50 μLの水 + 50 μL 調整済み接種材料2X RPMI-1640培地(抗真菌剤なし))を調製し、上記のようにウェルプレートにロードします。
- 試験する各化合物と選択した抗真菌コントロール(カラム4〜10)について、この手順を繰り返します
手記：段階希釈は、下の実験のように垂直に行うことも、プレート内で水平に行うこともできます(つまり、試験が必要な所定の化合物/抽出物の希釈回数が8回以上の場合)。
- 化合物、参照薬、またはその成分のいずれかが感光性である場合は、減光下でアッセイを行うか、プレートをホイルで覆うか、インキュベーション中に暗いチャンバーに入れてください。
- 次のオプションの推奨事項を検討してください。
- プレートを透明なカバープレートでシールすると、ガス交換が可能になり、蒸発を減らすことができます。
- プレートを湿度の高いチャンバーに置きます。これにより、蒸発も減少します。
- プレートを37°Cで24時間または48時間、すべてのC.アルビカンス株について、C.ネオフォルマンスについて200rpm振とうして48時間インキュベートします。最終容量が小さい(100 μL)ため、スピルオーバーが発生しません
手記： C. albicans株の24時間時と48時間でのMIC測定値の間に有意差は観察されませんでした。それにもかかわらず、48時間での読み取り値は視覚化しやすくなります。
- インキュベーション期間の前後に、倒立光学顕微鏡の助けを借りてすべてのウェルを観察し、形態の変化を確認し、汚染の兆候を確認します.
手記： 測定値は視覚的に行い、実験の最後に写真を撮ることができます。各読み取りの前に、プレートをわずかに均質化します。読み取りは、細胞の凝集やフィラメント形成が観察されない場合、600nmでODを測定することによっても実行できます。
- 別々の日に少なくとも 3 回実験を行います。
>表 1.培地および試薬の調製。
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| 中程度 | 準備 |
| 2X ロズウェル パーク メモリアル インスティテュート (RPMI) 1640 ミディアム – 500 mL | 10.4 g RPMI-1640 (L-グルタミンとフェノールレッドを添加、重炭酸塩を含まない) |
| 330 mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS) |
| NaOHでpH 7.0に調整 |
| ろ過(0.22 μMフィルター)による滅菌 |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | 137 mM NaCl |
| 2.7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| 121°Cで15分間オートクレーブします。 |
| Sabouraudデキストローススープ | 蒸留水500mLに粉末15gを入れます。 |
| NaOHでpH 7.0に調整 |
| 121°Cで15分間オートクレーブします。 |
| >Sabouraudデキストロース寒天 | 蒸留水500mLに粉末32.5g |
| NaOHでpH 7.0に調整 |
| 121°Cで15分間オートクレーブします。 |