抗生物質治療下での細菌生存率を決定するためのATP利用アッセイ

要約

出典:Wang, Liang-Chun, et al.ATPを利用した市販のアッセイと生/死染色を使用した淋菌凝集体の抗生物質感受性の定量的調査。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、ルシフェラーゼグロー試薬を使用した簡単なATP測定アッセイについて説明しています。このアッセイは、セフトリアキソンによる治療後の淋菌の生存率を定量するために使用されます。

プロトコル

1. GCアグリゲーションの生存率定量化

1. 滅菌アプリケーターを使用してGCを収集します。プレートからGCをスワブし、4.2%のNaHCO₃および1%のケロッグ溶液を添加した予熱したブロス(GCP、表1)にGCを再懸濁します。650 nm の波長 (OD 650 1 = ~1 x 10⁹ CFU/mL) の分光光度法を使用して、懸濁細菌の濃度を測定します。
2. GCの濃度を~1 x^{10 8} CFU/mLに調整します。
3. 99 μLの調整済みGC懸濁液を96ウェルプレートのウェルに加えます。
4. プレートを5%_CO2で37°Cで6時間インキュベートし、細菌が凝集するのを待ちます。
5. 1 μL の直列希釈セフトリアキソン (1000、100、50、25、12.5、6.2、3.1、1.5、0.8、0.4、0.2 μg/mL) を各ウェルに添加します。コントロールとして機能するために、いくつかの井戸を未処理のままにします。
6. プレートを5% CO₂と共に37°Cで24時間インキュベートします。
7. 懸濁液を各ウェルで3回、144 Wおよび20 kHzで5秒間超音波処理します。
8. 市販のATP利用グロー試薬100 μLを各ウェルに加え、ピペットで3回上下させ、5% CO₂で37°Cで15分間インキュベートします。
9. 各ウェルから150 μLの混合物を96ウェルの黒色マイクロプレート内の新しいウェルに慎重に移し、気泡が入らないようにします。
10. プレートリーダーを使用して、560 nmで各ウェルの吸光度を測定します。
11. 連続セフトリアキソン治療後に得られた測定値と未処理のウェルからの読み取り値の比率によって生存率を計算します。

2. GC凝集体のLive/Deadの蛍光顕微鏡分析

1. 滅菌アプリケーターを使用してGCを収集します。プレートからGCをスワブし、事前に温めたGCP培地と1%ケロッグサプリメントでGCを再懸濁します。
2. 波長650 nmの分光光度法により細菌の数を決定し、GCの濃度を~1 x^{10 7} CFU/mLに調整します。
3. 198 μLのGC懸濁液を8ウェルカバースリップボトムチャンバーに加えます。
4. チャンバーを5% CO₂で37°Cで6時間インキュベートし、凝集形成を可能にします。
5. 各凝集条件内で、2 μLのセフトリアキソン(100 μg/mLまたはさまざまな希釈液)を各ウェルに加えます。37°Cで5%CO₂で所望の時間インキュベートします。
6. 0.6 μLの生/死染色溶液混合物を各ウェルに加え、5% CO₂で37°Cで20分間インキュベートします。
7. 共焦点顕微鏡を使用してZシリーズの画像を取得します(同等の顕微鏡を使用できます)。
8. ImageJソフトウェアを使用して画像を解析し、GC凝集体のサイズと各凝集体における生死染色の蛍光強度比FIRを測定します。

>表1:GCP細菌増殖培地1Lのレシピ。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100倍ケロッグのサプリメント
寒天	アメリカ合衆国バイオロジカル	A0930 (英語)
BacTiter アッセイ	プロメガ	G8232
セフトリアキソン	TCIの	C2226
Difco GC ミディアムベース	BDの	228950
硝酸第二鉄、非水和物	シグマ・アルドリッチ	254223から10G
グルコース	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP350-1
BacLight生死染色	インビトゲン	L7012
MS11 淋菌			ハーマン・シュナイダー博士、ウォルター・リード陸軍研究所のご厚意により提供されました。
ソニケーター	コンテス		9110001と同等

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