試験薬に対するリンパ腫細胞の感受性における好中球様細胞の役割の解明

要約

出典:Hirz, T., et al. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、化学療法剤の細胞毒性からリンパ腫細胞を保護する好中球様細胞の役割を調査するアッセイを示しています。リンパ腫と好中球様細胞からなる3D共培養が確立され、化学療法薬であるビンクリスチンに曝露されます。好中球様細胞と直接接触すると、リンパ腫細胞内の抗アポトーシスタンパク質のアップレギュレーションが誘導され、それによってビンクリスチンの存在下でのリンパ腫細胞の生存が促進されます。

プロトコル

1. 3DモデルによるHL60細胞の顆粒球経路上の分化とRLリンパ腫B細胞との共培養

1. ヒト前骨髄球(HL60)細胞の好中球様細胞への分化
   1. HL60細胞数を3 x 10⁵細胞/mLに調整し、1 μMレチノイン酸(RA)と1.25% DMSOを添加して分化を誘導します。ウェルあたり各3 x 10⁵ HL60細胞を48ウェルプレートに播種し、5% CO₂で37°Cで48時間インキュベー
   トします。
   2. その後、細胞を回収し、RTで300 gで5分間遠心分離し、細胞生存率カウンターを使用してカウントするために、完全なRPMI培地で細胞を再懸濁します。
   3. 次に、細胞懸濁液を完全なRPMI培地で希釈してHL60細胞数を3 x 10⁵細胞/mLに調整し、1 μMレチノイン酸(RA)と1.25 %ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加して再度分化を誘導します。ウェルあたり3 x 10⁵ HL60細胞をそれぞれ48ウェルプレートに播種し、5% CO₂で37°Cでさらに48時間インキュベートします。
2. HL60の分化の解析(HL60diff)
   1. 細胞を採....

結果

図1. 分化したHL60細胞の構造パラメータ。(A)前方散乱光(FSC)および側方散乱光(SSC)プロットは、HL60および分化HL60細胞(HL60diff)を表し、(B)HL60およびHL60diff細胞を抗CD11b-AF700または抗CD38-APCで標識した後、フローサイトメトリー分析を行った。FSC-A対SSC-A散布図(A)で各細胞集団をゲーティングした後、細胞のCD11bまたはCD38の発現について分析した。写真は100倍の倍率で顕微鏡で撮影しました。太字の黒い矢印は、マルチローブの核を指しています。グラフは、5つの独立した実験を代表するものです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMIの1640	ギブコ Invitrogen	21875-034
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ Invitrogen	10270-106
リン酸緩衝生理食塩水(PBSにはカルシウムとマグネシウムが含まれています)	ギブコ Invitrogen	14040-091
ビンクリスチン	EGラボ
BDマトリゲル基底膜マトリックス	BDバイオサイエンス	354234	実験日の前夜、4°Cに置きます
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	D8418
レチノイン酸	シグマ・アルドリッチ	R2625
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A7906
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ・アルドリッチ	E5134
V-FLOS染色キットの付属	ロシュ	11 988 549 001
キットRAL 555 Modified Giemsa染色キット	コスモスバイオメディカル	CB361550-0000
LSRIIフローサイトメトリー	BDバイオサイエンス
細胞遠心分離機	サーモサイエンティフィック
ライカ DMR-XA 顕微鏡	ライカマイクロシステムズ
セロメータ自動T4細胞生存率カウンター	ネクセロムバイオサイエンス

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