試験薬に対するリンパ腫細胞の感受性における好中球様細胞の役割の解明

要約

出典:Hirz, T., et al. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、化学療法剤の細胞毒性からリンパ腫細胞を保護する好中球様細胞の役割を調査するアッセイを示しています。リンパ腫と好中球様細胞からなる3D共培養が確立され、化学療法薬であるビンクリスチンに曝露されます。好中球様細胞と直接接触すると、リンパ腫細胞内の抗アポトーシスタンパク質のアップレギュレーションが誘導され、それによってビンクリスチンの存在下でのリンパ腫細胞の生存が促進されます。

プロトコル

1. 3DモデルによるHL60細胞の顆粒球経路上の分化とRLリンパ腫B細胞との共培養

1. ヒト前骨髄球(HL60)細胞の好中球様細胞への分化
   1. HL60細胞数を3 x 10⁵細胞/mLに調整し、1 μMレチノイン酸(RA)と1.25% DMSOを添加して分化を誘導します。ウェルあたり各3 x 10⁵ HL60細胞を48ウェルプレートに播種し、5% CO₂で37°Cで48時間インキュベー
   トします。
   2. その後、細胞を回収し、RTで300 gで5分間遠心分離し、細胞生存率カウンターを使用してカウントするために、完全なRPMI培地で細胞を再懸濁します。
   3. 次に、細胞懸濁液を完全なRPMI培地で希釈してHL60細胞数を3 x 10⁵細胞/mLに調整し、1 μMレチノイン酸(RA)と1.25 %ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加して再度分化を誘導します。ウェルあたり3 x 10⁵ HL60細胞をそれぞれ48ウェルプレートに播種し、5% CO₂で37°Cでさらに48時間インキュベートします。
2. HL60の分化の解析(HL60diff)
   1. 細胞を採取し、チューブを300gでRTで5分間遠心分離し、完全なロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地でペレットを再懸濁し、細胞生存率カウンターを使用してカウントします。
   2. フローサイトメトリーによる細胞表面マーカー発現の変化を解析する。蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)分析のために、3 x 10⁵ 5 未分化HL60細胞(細胞培養由来)と 3 x 10⁵ HL60diff 細胞をそれぞれ 5 mL プラスチックチューブに入れ、チューブを 300 g で RT で 5 分間遠心分離します。
   3. ペレットを50 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)-ウシ胎児血清(FBS)(4%)に再懸濁します。AF700に結合した抗ヒトCD11b、またはAPCに結合した抗ヒトCD38(5 μl/10⁶細胞)で細胞を標識します。細胞を暗所で4^°Cで30分間インキュベートします。
   4. 500 μl PBS-FBS (4%) で洗浄し、300 g で RT で 5 分間遠心分離します。ペレットを 200 μl PBS-FBS (4%) に再懸濁します。
   5. 図 1A のゲーティング戦略と次の光学構成を使用して、フローサイトメーターで解析します:488 nm レーザー:FSC-A (488 nM)、SSC-A (488/10BP)、633 nm レーザー:APC (660/20 BP)、Alexa Fluor 700 (730/45 BP)。
   6. HL60diffの形態学的変化をテストするには、顕微鏡検査のために細胞をスライドガラスに固定化します。
      1. これを行うには、3 x 10⁴ 未分化HL60細胞(細胞培養由来)と3 x 10⁴ HL60diffをそれぞれ150 μlの完全RPMI培地に再懸濁します。スライドガラス、フィルターカード、サンプルチャンバーをサイトスピン遠心分離機に組み立て、遠心分離機のバランスが取れていることを確認します。
      2. 各細胞タイプをサンプルチャンバーに入れ、室温で1,500 rpmで10分間細胞遠心分離機にかけます。スライド、フィルターカード、およびサンプルチャンバーを遠心分離機から取り出します。スライド上のセルを傷つけないように、慎重に分解してください。フィルターカードとサンプルチャンバーは廃棄します。
      3. Gemsa染色キットを使用して細胞を染色し、スライドを1時間乾燥させます。顕微鏡で100倍の倍率で細胞を検査します。
3. 3次元(3D)Culture
   手記：この実験で使用する材料が冷たく、実験が氷の上で行われていることを確認してください。
   1. 各5 x 10⁴ RL細胞を、単独で、またはHL60diffと混合し、RL:HL60diff 1:10の比率で、300 μlの基底膜マトリックスと混合し、滅菌ハサミで切断した1 mLのピペットチップを使用して、開口部を約2〜3 mmに広げます。
   2. 各300 μlの細胞懸濁液/ウェルを24ウェルプレートに播種します。このステップでは、気泡を避けてください。プレートを5% CO₂で37°Cで30分間インキュベートし、各ウェルに1 mLの完全RPMI培地を加え、5% CO₂で37°Cで7日間インキュベートします。メディアは2日ごとに交換してください。5日目に10 nMのビンクリスチンを加えます。
4. FACS分析
   1. 7日間の培養後、培地を吸引し、1mlの氷冷PBSで各ウェルを2回洗います。氷冷PBS-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(5 mM)を3 mL/ウェル加えます。200 μlピペットチップの底を使用してこすり落とし、ウェルの底からゲルをはがします。プレートを氷の上で30分間静かに振ってください。
   2. 細胞懸濁液を滅菌済みの15mlチューブに移し、チューブを氷上でさらに30分間静かに振とうします。(そうでない場合は、細胞を長時間振るか、PBS-EDTAを追加します)。
   3. チューブを300 x gでRTで10分間遠心分離し、ペレットをPBSで洗浄し、RTで300 x gで10分間遠心分離します。
   4. PBS-FBS(4%)で再懸濁し、PE-Cy7に結合した抗ヒトCD19抗体およびAPCに結合した抗ヒトCD38抗体(5 μl/10⁶細胞)で標識します。暗所で4^°Cで30分間インキュベートします。
   5. 500 μL PBS-FBS (4%) で洗浄し、チューブを 300 g で RT で 5 分間遠心分離し、市販のキットを使用して Annexin V と PI で細胞を再懸濁します。
   6. 図 2A のゲーティング戦略と次の光学構成を使用して、フローサイトメーターで解析します:488 nm レーザー:FSC-A (488 nM)、SSC-A (488/10BP)、FITC (530/30 BP)、PI (610/20 BP)、PE-Cy7 (780/60 BP)、633 nm レーザー:APC (660/20 BP)。色補正を確認してください。

結果

図1. 分化したHL60細胞の構造パラメータ。(A)前方散乱光(FSC)および側方散乱光(SSC)プロットは、HL60および分化HL60細胞(HL60diff)を表し、(B)HL60およびHL60diff細胞を抗CD11b-AF700または抗CD38-APCで標識した後、フローサイトメトリー分析を行った。FSC-A対SSC-A散布図(A)で各細胞集団をゲーティングした後、細胞のCD11bまたはCD38の発現について分析した。写真は100倍の倍率で顕微鏡で撮影しました。太字の黒い矢印は、マルチローブの核を指しています。グラフは、5つの独立した実験を代表するものです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMIの1640	ギブコ Invitrogen	21875-034
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ Invitrogen	10270-106
リン酸緩衝生理食塩水(PBSにはカルシウムとマグネシウムが含まれています)	ギブコ Invitrogen	14040-091
ビンクリスチン	EGラボ
BDマトリゲル基底膜マトリックス	BDバイオサイエンス	354234	実験日の前夜、4°Cに置きます
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	D8418
レチノイン酸	シグマ・アルドリッチ	R2625
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A7906
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ・アルドリッチ	E5134
V-FLOS染色キットの付属	ロシュ	11 988 549 001
キットRAL 555 Modified Giemsa染色キット	コスモスバイオメディカル	CB361550-0000
LSRIIフローサイトメトリー	BDバイオサイエンス
細胞遠心分離機	サーモサイエンティフィック
ライカ DMR-XA 顕微鏡	ライカマイクロシステムズ
セロメータ自動T4細胞生存率カウンター	ネクセロムバイオサイエンス

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