細胞傷害性Tリンパ球応答における免疫優性を評価するためのアッセイ

要約

出典: Choi, J. et al., Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8⁺ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、細胞傷害性Tリンパ球またはCTL応答における免疫優性をアッセイするためのフローサイトメトリーベースのアッセイを紹介しています。注入された蛍光標的細胞は、免疫原性エピトープに対応するさまざまな蛍光を示します。脾臓の採取と選別後、高強度蛍光細胞の減少が明らかになり、CTL応答の免疫優性が確認されました。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. C57BL/6マウスへのT Ag発現腫瘍細胞の接種

1. SV40形質転換線維肉腫細胞株C57SV(または類似のT Ag⁺接着細胞株)をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で4.5 g/L D-グルコースおよびL-グルタミン(1x)を添加し、1 mMピルビン酸ナトリウムおよび10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を添加した組織培養処理フラスコで、10%二酸化炭素(CO₂)を含む加湿雰囲気で37°Cで
増殖させます。
2. 細胞が完全にコンフルエントになったら、またはわずかにオーバーコンフルエントになったら、培地を静かに取り出して廃棄し、予め温めた滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で単層をすすぎます。
   注:T Ag ⁺細胞が100%のコンフルエンシーに達すると、T Agの発現が最大化されます。
3. 生物学的安全キャビネット内に、予熱したトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(トリプシン-EDTA)(0.25%)を添加し、細胞がパッチ状に剥がれるまで室温で単層を覆います。培養フラスコの側面を数回軽くたたいて、残りの付着細胞を放出します
   注:必要に応じて、トリプシン化プロセスを迅速化するために、フラスコを37°Cのインキュベーターに移します。ずれた細胞は、光学顕微鏡下ですぐに丸みを帯びた形状になります。この手順は約 5 分続きます。
4. 5 mLのDMEM培地を加え、各フラスコの内容物をピペッティングして塊を解離し、シングルセル懸濁液を調製します。
5. 細胞懸濁液を70μmの細孔を有する細胞ストレーナーを通してチューブに移します。
6. チューブを400 x gで4°Cで5分間スピンダウンします。
7. 上清を捨てます。ペレット化した細胞を10 mLの滅菌済み冷PBSに再懸濁します。
8. 手順 1.6 と 1.7 を 2 回繰り返します。
9. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。4 x 10⁷細胞/mLの滅菌PBSを含む均一な懸濁液を調製します。
10. 上記の懸 ?? 液500 μLを腹腔内(i.p.)に各成体(6〜12週齢)の雄または雌のC57BL / 6マウスに注入します。.

2. 治療計画

1. _tCD8免疫優性に対するnTreg細胞の寄与を調べるための治療計画
   1. C57BL/6マウスにC57SV細胞をin vivoでプライミングする4日前(ステップ1.10)に、nTreg細胞を枯渇させる低エンドトキシン、アジドフリーの抗CD25モノクローナル抗体(mAb)(クローンPC-61.5.3)を各動物に1回ずつ注射するか、ラットIgG1アイソタイプコントロール(クローンKLH/G1-2-2、クローンHRPN、クローンTNP6A7など)を注射します。
2. プログラムされた細胞死タンパク質(PD-1-PD-L1(2))相互作用のT_CD8免疫優性の形成におけるIn vivoの重要性をテストするための治療レジメン
   注:PD-L1によるPD-1の関与は、常にではありませんが、しばしばAg特異的T_CD8の共阻害および/または枯渇を媒介します。したがって、抗PD-1による治療は、抗PD-L1および抗PD-L2モノクローナル抗体の投与と並行して行うことができ、生物学的現象に関与する正確な細胞間相互作用を明らかにすることができます。

>3. 標的脾細胞の調製

1. 性別が一致したナイーブなC57BL / 6マウス(6〜12週齢)を安楽死させます。これは、子宮頸部脱臼によって脾細胞ドナーとして機能します。
2. 各マウスの腹部を上に向けて、生物学的安全キャビネット内に配置します。70%(v / v)エタノール、EtOHを皮膚にスプレーします。滅菌鉗子とはさみを使用して、皮膚を持ち上げ、腹側正中線を小さく切開します。次に、皮膚を十字に切るように切って腹膜を露出させます。
3. 鉗子を使用して、内臓をひったくることなくテントのように腹膜を引き上げます。腹膜を切開して腹腔を露出させ、脾臓をそっと取り除きます。
4. 5 mLの滅菌PBSを含む15 mLのDounceティッシュグラインダーに脾臓を入れます。グラインダーのガラスプランジャーを使用して、脾臓組織が赤い均質な細胞懸濁液に消散するまで手動で圧力をかけます.
   注:実験群あたりのレシピエント動物の数によっては、標的細胞の調製にいくつかのドナーマウス脾臓が必要になる場合があります。最大3つの脾臓を15mLグラインダー内で一緒に均質化できます。
5. ホモジネートを15mLチューブに移します。チューブを400 x gで4°Cで5分間スピンダウンします。
6. 上清を捨てます。ペレット化した細胞を4 mLのアンモニウム-塩化-カリウム(ACK)溶解緩衝液に4分間再懸濁して、赤血球を除去します><。 注:これは時間的制約のある手順です。脾臓細胞をACK溶解バッファーに過剰に曝露すると、脾臓細胞の脆弱性が高まり、非特異的な細胞死にかかりやすくなります。
7. 各チューブに、10% 熱不活化 FBS、L-アラニル-L-グルタミン、0.1 mM 最小必須培地 (MEM) 非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、および 1x ペニシリン/ストレプトマイシンを含む 8 mL のロズウェル パーク メモリアル インスティテュート 1640 (RPMI 1640) 培地を追加します。これらは、以下、完全 RPMI 培地と呼ばれます (材料表)。
8. 内容物をセルストレーナーの70 μmの細孔から新しい15 mLチューブに移します。
9. チューブを400 x gで4°Cで5分間スピンダウンします。
10. 上清を捨てます。ペレット化した細胞を12 mLの完全RPMIに再懸濁します。
11. 脾細胞懸濁液を3つの別々のチューブで3等分(各4mL)に分割します。

4. 標的脾細胞を無関係で同族のペプチドでコーティングする

1. 標的脾細胞をパルスするために使用されるペプチドに従ってチューブを標識します。対照脾細胞には無関係なペプチドをパルス化し、同族の標的脾細胞の各集団には、T Ag由来の免疫優性エピトープ(サイトIV)またはサブドミナントのT Agエピトープ(サイトIまたはサイトII/III)に対応する合成ペプチドをパルス化します(表1)
   注:無関係なペプチドの選択は、実験のセットアップと各調査で使用したマウス系統によって異なります。著者らは、C57BL/6マウスにおいて、gB_498-505(単純ヘルペスウイルス[HSV]-1のH-2K^b制限免疫優性ペプチドエピトープ)および/またはGP_33-41(リンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス(LCMV)のH-2D^b制限免疫優性ペプチドエピトープ)をよく使用します(表1)。これらのペプチドは、次の理由で最適な選択肢です:(i)ここで説明したマウスモデルで以前に遭遇しなかった病原体に由来します。(ii)T Ag由来ペプチドと同様に、gB_498-505およびGP_33-41はH-2 b分子によって制限され、H-2^b分子に結合します。「3ピーク」in vivo殺傷アッセイでは、同族の標的細胞に対応する2つのピークのそれぞれが、免疫優性または劣性ペプチドでパルス化された脾細胞を表している可能性があります。各ペプチドセットの選択は、各実験の目的によって異なります。このようなバリエーションの例として、図 1 と図 2 を参照してください。このプロトコルの残りの部分では、T Ag由来のサイトIおよびIVは、それぞれサブドミナントペプチドおよび免疫ドミナントペプチドを表します。
2. 各標識チューブの含有量を、それぞれのペプチド1 μMで37°Cおよび5%CO₂で1時間パルスします。
3. 必要に応じて、チューブごとに別々のセルストレーナー(70μmの細孔付き)を使用して、凝集物や破片を取り除きます。
4. チューブを400 x gで4°Cで5分間スピンダウンし、上清を捨てます。
5. ペレット化した細胞を12 mLの滅菌冷PBSに再懸濁し、ステップ4.4をもう一度繰り返します><。 注:FBSは次のステップでカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)に結合できるため、できるだけ多くのFBSを除去することが重要です。

>5. CFSEによる標的脾細胞の標識

1. ペプチドパルス脾細胞を4 mLの滅菌PBSに再懸濁します。
2. 0.025 μM、0.25 μM、および2 μMのCFSEを、無関係なペプチド、部位I、および部位IVパルス脾細胞を含むチューブにそれぞれ追加します。
   注:均一なCFSE標識を実現するには、各チューブを45°の角度で保持してから、細胞懸濁液の少し上の側にCFSEを追加し、すぐに穏やかなボルテックスを行います。これにより、最後に滑らかなヒストグラムが表示されます。バッチ間および経年変化によるCFSE強度の変動は珍しくありません。したがって、使用する最適な濃度を決定する前に、異なるCFSE用量で実験する必要があるかもしれません。
   注意：CFSEは、5μMを超える濃度で毒性を示します。
3. チューブを37°Cのインキュベーター内に15分間入れ、5分ごとに1回反転させます。
4. 各チューブに3 mLの熱不活化FBSを加えて、CFSE反応を停止します。滅菌PBSでコンテンツを補充します。
5. チューブを400 x gで4°Cで5分間スピンダウンし、上清を捨てます。
6. ペレット化した細胞を12 mLの滅菌PBSに再懸濁し、ステップ5.5を繰り返します。

>6. 標的脾細胞集団の適切/均等なCFSE標識の検討

1. ペレット化した細胞を3 mLのPBSに再懸濁します。
2. チューブを優しく渦巻きます。CFSE^低細胞懸濁液、CFSE^{中間細胞(int)、}およびCFSE^高細胞懸濁液をそれぞれ10 μLを、200 μLのPBSを含む5 mLの丸底ポリスチレン蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブに移します。
3. 488 nmレーザーを搭載したフローサイトメーターを使用して細胞を調査します。FL-1チャネルのリンパ球ゲート内に収まる5000のイベントを取得する前に、細胞の前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)特性に基づいてリンパ球ゲートを描画します。
4. 「親」CFSE⁺母集団内で、追加のヒストグラムゲートを描画して、CFSE^low、CFSE^int、およびCFSE^highサブポピュレーションを特定します。
5. 3つのゲート内で等しいまたはほぼ等しいイベント番号を確認します。必要に応じて、「ソース」チューブ内の細胞数を調整し(ステップ6.1)、セクション7で標的脾細胞をナイーブマウスとプライミングマウスに混合して注入します。

>7. ナイーブおよびT-AgプライムレシピエントへのCFSE標識標的細胞の注入

1. ソースチューブを静かに渦巻きます。3つのCFSE標識細胞懸濁液を同じ比率で新しいチューブに移します。
2. 滅菌PBSでコンテンツを補充します。
3. チューブを400 x gで5分間、4°Cでスピンダウンし、ペレット化した細胞を滅菌PBSで再懸濁します。
4. トリパンブルーの細胞を血球計算盤でカウントし、細胞生存率が少なくとも95%であることを確認します。
5. 1 x 10^{7 混合}ターゲット細胞/200 μL PBS を尾静脈を介して各レシピエント C57BL/6 マウスに静脈内 (i.v.) 注入するために、容量を調整します><。 注:注入の合間に細胞を氷上に保管します。各注入前に標的細胞を穏やかに混合します。各マウスの正確な注射時間を記録し、それによって動物を安楽死させる必要がある時期を決定します。同じ実験において、すべての動物間でin vivo細胞毒性の持続時間を一定に保つことが重要です。

8. データ取得

1. CFSE標識標的細胞の注射の2〜4時間後、レシピエントマウスを子宮頸部脱臼により安楽死させる。
   注:in vivo細胞毒性の持続期間は、使用する実験系、標的Agの免疫原性、脾臓におけるペプチド抗原特異的T_CD8の予想される存在量、および他の要因の中でも特にそれらの溶解機能の堅牢性によって異なります。
2. ステップ3.2−3.9のように、各脾臓を別々に取り外して処理します。
3. 上清を捨て、ペレット化した細胞を3mLのPBS.
   に再懸濁します 注:細胞蛍光分析の前に、脾臓組織および細胞調製物を4°Cまたは氷上で取り扱うには特に注意してください。これは、ex vivoでの継続的な細胞毒性を防ぐためです。
4. 各処理された脾臓から約1x10⁷細胞をきれいなFACSチューブに移します。
5. 488 nmレーザーを搭載したフローサイトメーターを使用して、細胞を直ちに調査します。細胞のFSCおよびSSC特性に基づいてリンパ球ゲートを描画します。
6. CFSE^レシピエントの脾細胞とCFSE⁺転写標的細胞を同定します。異なるCFSE^low、CFSE^int、およびCFSE^highターゲット細胞集団に対応する追加のゲートを描画します。
7. FL-1チャンネルで合計2000のCFSE^低イベントを取得します。

>9. データ分析

1. 次の式を使用して、各同族の標的細胞集団の特異的溶解を計算します:
   % 比細胞毒性 =
   ここで、x = T AgプライムマウスのCFSE^int/highイベント数、y = T AgプライムマウスのCFSE^低イベント数、a = ナイーブマウスのCFSE^int/highイベント数、b = ナイーブマウスのCFSE^低イベント数です。
   手記：複数の同族標的集団の特異的溶解が評価される「3ピーク」細胞毒性アッセイでは、標的細胞頻度を使用することは適切ではありません。これは単に、同族の標的細胞集団の頻度が、無関係なコントロールの割合だけでなく、他の同族の標的脾細胞の割合によっても影響を受けるためです。したがって、各ゲート内のイベント番号を上記の式で使用して、CFSE^lowコントロールに対する各同族の標的細胞集団(CFSE^intまたはCFSE^high細胞)の溶解を正確に計算する必要があります。

>表 1.このプロトコルで導入されるペプチド。

の

タンパク質抗原源	ペプチドエピトープ	指定	順序	MHC I の制限
SV401 ラージT農業2	T Ag206-215	サイトI	ザインヤックル	H-2Dのb
SV40 ラージT農業	T AG223-231	サイトII/III	CKGVNKEYLの	H-2Dのb
SV40 ラージT農業	T AG404-411	サイトIV	VVYDFLKCの	H-2K戦闘機
SV40 ラージT農業	T AG489-497	サイトV	QGINNLDNL	H-2Dのb
HSV-13 糖タンパク質B	GB498-505*	GBの498-505	SSIEFARL	H-2K戦闘機
LCMV4糖タンパク質	GP33-41*	GPの33-41	カビンファト	H-2Dのb
1シミアンウイルス40
2大きな腫瘍抗原
3単純ヘルペスウイルス1型
>4リンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス
*無関係なペプチドとして使用されます

結果

図1:nTreg細胞の存在下または非存在下でのT Ag由来エピトープに対するT_CD8媒介性細胞毒性の代表的な細胞蛍光分析。 コントロールペプチド(サイトIまたはサイトIV)をパルス化した標的脾細胞を、CFSEで差次的に標識し、ナイーブマウス(左パネル)、PBS注入T抗原マウス(中央パネル)、PC61(nti-CD25)注入(nTreg枯渇)T Agプライミングマウス(右パネル)の脾臓でフローサイトメトリーにより追跡しました。標的細胞の特異的殺傷率は、プロトコルに記載されている式を使用して計算され、代表的な数値が示されています。この図は、Haeryfar et al. の許可を得て採用したものです。著作権2005。米国免疫学会

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA (1X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25200-056
ACKライジングバッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1049201
抗マウスCD25(クローンPC-61.5.3)	バイオXセル	BE0012
抗マウスPD-1(クローンRMP1-14)	バイオXセル	BE0146
CFSEの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C34554
DMEMの (1X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11965-092
ウシ胎児血清(FBS)	Wisent Bioproducts(ワイセントバイオプロダクツ)	〒080-150	使用前に熱不活性化してください
GlutaMAX (100倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050-061
HEPESの(1M)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630080	10 mM の最終濃度
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140-050
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	P0781	在庫は100倍
ラットIgG1(クローンKLH/G1-2-2)	サザンバイオテクノロジー	0116-01	アイソタイプ制御
ラットIgG1(クローンHRPN)	バイオXセル	BE0088	アイソタイプ制御
ラットIgG1(クローンTNP6A7)	バイオXセル	BP0290	アイソタイプ制御
ラットIgG2a(クローン2A3)	バイオXセル	BP0089	アイソタイプ制御
RPMI 1640 (1Xの)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11875-093
ピルビン酸ナトリウム(100 mM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360-070	1 mM の最終濃度