TIRF顕微鏡法によるファゴソームの形成と閉鎖の可視化

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

注:Lifeact-mCherryを使用しているプラスミドは、パリのキュリー研究所のギヨーム・モンタニャック博士からのご厚意によりご

1. 細胞とトランスフェクション

>注:RAW264.7マクロファージは、100 mmプレート内の完全培地(RPMI(ロズウェルパークメモリアルインスティテュート)1640培地、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、50 μM β-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン、10%FCS(子牛胎児血清))でサブコンフルエントまで成長します。それらは、エレクトロポレーションによって蛍光タグ付きタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクションされます。通常、約5 - 6 x 10⁶細胞に、トランスフェクションまたはコトランスフェクションごとにそれぞれ20 μgまたは10 μgのプラスミドをトランスフェクションします。エレクトロポレーションまたはリポフェクションに基づく他のトランスフェクション手段が代替アプローチとして使用できることに注意してください。

1. セルリフターで細胞をこすり落とし、ピペッティングを数回上下させて10mlの培地に再懸濁します。
2. 細胞懸濁液300 x gをRTで5分間、スイングアングルローターで遠心分離します。
3. 10 μg/ml のゲンタマイシンを添加した 10 ml の完全培地を 37 °C で予熱します。
4. 遠心分離後、上清を捨て、エレクトロポレーションキットから3 mLの「洗浄バッファーA」にペレットを再懸濁します。
5. 細胞懸濁液300 x gを、揺動角ローターで室温で5分間遠心分離します。
6. その間に、室温でDNAミックスを調製します:120 μl 2x Buffer B、目的タンパク質をコードするプラスミドDNA20 μg、q.s.p. 240 μl H₂O。
7. 遠心分離後、上清全体を捨てます。
8. 細胞ペレットをDNA混合物に再懸濁し、4 mmエレクトロポレーションキュベットに移します。
9. 室温で3分間インキュベートします。
10. 250 V、900 μFでエレクトロポレーションします。
11. ゲンタマイシンを添加した予熱済み(37°C)の完全培地に細胞を直ちに再懸濁し、100 mmのディッシュにプレートします。
12. トランスフェクションした細胞を37°C、5%CO₂で一晩インキュベートします。
13. 翌朝、培地全体を10 mLの無血清顕微鏡培地(RPMI 1640、フェノールレッドなし、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、50 μM β-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン)と交換します。

2. 赤血球のオプソニン化

>注:マクロファージの粒子標的のモデルとして、ヒツジ赤血球(SRBC)が使用されています。通常、35 mmのガラス底皿あたり約7 x 10⁶ SRBCが使用されます。

1. SRBCを1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)/0.1%BSA(ウシ血清アルブミン)100μlで洗浄し、遠心分離(600 x g、4分)します。
2. 遠心分離後、上清を捨て、SRBCを1x PBS/0.1% BSAの100 μlに再懸濁し、遠心分離(600 x g、4分間)します。
3. 遠心分離後、上清を廃棄し、SRBCを1x PBS/0.1% BSAに、ウサギIgG抗SRBCsを亜凝集濃度で再懸濁します。抗体を含む溶液500μl/SRBCs.
   5μlを使用 手記： 抗体の亜凝集濃度は、ネットワークの形成として検出される凝集を誘導しなかった最低濃度に相当します。一般に、亜凝集濃度は8.2μg/mlです。
   1. SRBCのオプソニン化に必要なIgG抗SRBCの濃度を、赤血球凝集試験により決定します。マイクロプレートでIgG抗SRBC(ストック13.1 mg / ml)を1/50〜1/25,600で段階希釈します。各ウェルに2 x 10⁶個のSRBCを添加します。プレートを暗闇の中でRTで数時間インキュベートします。
4. 室温で30分間、ゆっくりと回転させてインキュベートします。
5. 上記のように1x PBS/0.1% BSAで2回洗浄した後、IgGオプソニン化SRBC(IgG-SRBC)を予熱した無血清顕微鏡培地(2 mL/皿)に再懸濁します。

3. カバースリップのポリリジンコーティング

1. その間に、底部35 mmのガラス皿を2 mLの0.01%ポリ-L-リジンで室温で30分間処理します。
2. 2mlの1x PBSで皿を2回洗います。

4. ガラス底皿へのSRBCの非共有結合固定

1. 35 mmのガラス底皿あたり2 mlのSRBC懸濁液を注ぎます。
2. スイングローターを500 x gで2分間遠心分離し、35 mmのガラス底皿に遠心分離します。
3. 上清を取り除き、2 mlの1x PBS/10% BSAで1回洗浄します。
4. 1皿あたり2 mLの1x PBS/10% BSAで粒子を30分間インキュベートします。
5. 2 mlの1x PBSで皿を3回洗います。
6. 1x PBSを2 mLの温めた(37°C)無血清顕微鏡培地と交換します。

5. TIRFMで可視化する食作用

1. 顕微鏡
   手記：TIRFMは、油浸対物レンズ(N 100X, NA1.49)、CO₂加熱チャンバー、1.5倍レンズを結合した2台の単一光子検出カメラEMCCD(Electron Multiplying Charge Coupled Device)を備えた顕微鏡を用いて行いました。
   1. TIRF顕微鏡セッションの前日、37°Cの加熱チャンバーをオンにして、顕微鏡ステージを均一に加熱できるようにします。
2. 臨界角度決定
   手記：ImageJ Color Profilerソフトウェアは、TIRF画像ストリームの処理に使用されます。
   1. オプソニン化SRBCを含む35 mmガラス底皿を無血清顕微鏡培地とともに顕微鏡下に置きます。
   2. 細胞をこすり落とし、培地に再懸濁してから、皿(100〜500μl)に加えます。
   3. 「Live Acquisition」ソフトウェアを使用して顕微鏡を制御し、491 nmおよび/または561 nmレーザーで励起を行い、蛍光タグ付きタンパク質を発現する細胞を同定します。
   4. 蛍光標識タンパク質を発現する細胞を同定します。
   5. フィールドの中央に配置し、1つの励起波長で500枚の画像を、0°から5°まで、0.01°刻みで取得します(図1A)。角度は顕微鏡システムによって自動的に変更されます。
   6. 入射光がガラス/媒体界面で完全に反射され、エバネッセント波を発生させることができる臨界角度を決定します。ImageJ Color Profiler ソフトウェアを使用して、「ファイル」、「開く」をクリックして画像シーケンスを開き、ファイルを選択します。
   7. 長方形のツールを使用して、均一な蛍光を発する細胞内の関心領域(ROI)を選択します(図1B、黄色1)。
   8. 「Image」タブ、「Stacks」、および「Plot Z-axis Profile」(図1B、赤、2)をクリックして、ROIで測定された蛍光強度をx軸上の角度の関数とともにプロットします。(図1B、赤、2)
      注:臨界角は、蛍光が急激に減少する前に最大蛍光につながる角度です。
   9. 顕微鏡セッション中に、臨界角度よりも優れたx軸上の任意の角度の値を使用して、例2.00(図1C)のようにTIRF信号を取得します。
3. 買収
   1. Live Acquisitionソフトウェアを使用して、「Protocol Editor」モジュールで取得のパラメータを設定します(図2A)。
      1. TIRF領域の目的のタンパク質から蛍光シグナルを取得するための「Multi Channels」取得を含む「ループ」を持つプロトコルを作成します。TIRF角度(例:2.00)、露光時間(例:50 msec)、レーザー強度(例:50%)を入力します(図2B、1)。
      2. TIRF領域の3 μm上に対物レンズの「Z移動」を導入し、「Multi Channels」ツールを使用して落射蛍光で信号取得を取得します。臨界角(例:1.00)、露出時間(50ミリ秒)、レーザー強度(50%)より下の角度を入力します(図2B、2、3)。
      3. 次に、TIRF領域に戻るために、下に3μmの対物レンズの「z移動」を追加します(図3B4)。セルの「スナップショット」を明るい光LED(発光ダイオード)に追加します(図2B5)。
   2. 粒子の周囲に原形質膜を伸ばすことによりSRBCの食作用を開始する、中程度のレベルの蛍光標識タンパク質発現を持つ目的の細胞を見つけます。
   3. フィールドの中央に配置します。
   4. 500 - 1,000フレームのストリーミング取得を開始します。[loop count] タブで、「750 frames」と入力します (図 2B 1).
      手記：ImageJ Color Profilerソフトウェアは、TIRF画像ストリームの処理に使用されます。
   5. Image Jソフトウェアでシーケンス画像を開くには、「ファイル」、「開く」をクリックし、ファイルを選択します。
   6. 「画像」、「Hyperstacks」ドロップダウンメニュー、および「Stack to hyperstack」機能をクリックして、チャネルを分離します。表示されたウィンドウを完成させます: 注文: xyctz;チャンネル(c):チャンネルの数(例:蛍光色素が2つある場合は「2」)。スライス(z):z軸のスライスの数(例:z軸に動きがない場合は「1」)。フレーム (t): チャンネル数ごとに割った画像の数。表示モード:Grayscale.
      手記：2 つの異なるチャネルに対応する 2 つの別々の画像シーケンスが生成されます。

図 1.TIRFMによって分析された「Phagosome Closure Assay」の概略図。ファゴソームクロージャーアッセイは、1つまたは2つの蛍光タグ付きタンパク質を一過性に発現するマクロファージを用いて実施されます。マクロファージは、ポリリジンコーティングされたカバースリップに非共有結合的に固定されたIgGオプソニン化SRBCに沈着します。画像は、ファゴソームの閉鎖部位を検出するためにTIRFモードで記録され、食細胞カップの基部を検出するために落射蛍光モードで記録されます。

図2:TIRFMの臨界角の決定。(A)「Live acquisition」を用いて、蛍光標識タンパク質を発現する細胞をフィールドの中央(領域1の赤)に配置します。TIRFスタックオプションでは、0°から5°までの異なる角度で、1つの励起波長で画像を取得し、0.01°刻みで取得しました(領域2は赤)。(B)ImageJ Color Profilerソフトウェアを使用して画像のシーケンスを開き、関心領域の平均蛍光強度(ROI)を「Stacks」と「PlotZ axis profile」(領域1の赤)を使用してx軸上の角度の関数でプロットします。(C)プロット上の蛍光ピークのx位置は、臨界角1.98°(黒の点線)に対応します。この角度より後の任意の値を使用できます。例として、2.00°を選択できます(赤い線)。

図 3.Live Acquisition Moduleを使用したワークフロープロセス:「Protocol Editor」。(A) 「Protocol Editor」ウィンドウで、ワークフローキャンバスが作成されます。(B)このプロトコルは、顕微鏡がユーザーによって決定された回数繰り返すアクションの「ループ」を含む。例として、750 (1) です。1つのループが含まれています:TIRFモードでの目的の蛍光タンパク質のレーザー励起による「マルチチャンネル」取得。例として:レーザー491nm強度50%-TIRF角度2.00(2);対物レンズの「Z移動」3μm(3)。落射蛍光モードでの「マルチチャンネル」取得(4);対物レンズの「Z移動」をTIRF領域に戻す(5)と透過光の「スナップショット」(6)。