白血球増殖に対する単球の免疫調節影響を評価するためのIn vitroアッセイ

要約

出典:Hsu, P., et al. Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs). J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、間葉系幹細胞(MSC)がエフェクターT細胞の増殖に及ぼす免疫調節効果を調査するためのin vitroアッセイを実演しています。このアッセイには、MSCとPBMCの共培養が含まれ、単球集団が免疫調節表現型を獲得するように誘導し、インターロイキン-10(IL-10)の分泌につながります。活性化されたCD4⁺ T細胞とのインキュベーション後、誘導された単球はT細胞の増殖を効果的に抑制します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の密度勾配分離

1. 25 mLのヘパリン処理全血を25 mLのピペットで50 mLのチューブに加えます。.
   1. 25 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を希釈します。
2. 15 mLのFicoll-Paque密度勾配を新しい50 mLチューブに加え、チューブを傾けながら、希釈した細胞懸濁液25 mLを密度勾配に非常にゆっくりと慎重に追加します。これにより、全血が密度勾配と混合されない、つまり、血液-密度勾配界面が乱れることはありません。.
3. ステップ1.2の懸濁液を400 × gで30〜40分間、ブレーキなしの温度制御スイングバケットローターで20°Cで遠心分離します
   手記：遠心分離後に3つの異なる層が明らかになるはずです:上層はプラズマです。下部のクリアレイヤーはFicoll-Paque密度グラデーションです。そして、PBMCである薄い中間の細胞層。
4. パスツールピペットで吸引することにより、単核細胞(すなわち、リンパ球、単球、および血小板)の期間層を乱さないように注意して、上層を吸引して廃棄します。
5. この単核細胞層を10 mLピペットで新しい50 mL遠心チューブに慎重に集めます。
6. チューブに20mlのPBSを充填し、よく混合し、300 × gで20°Cで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を完全に取り除きます。
7. 細胞ペレットを20mlのPBSに再懸濁し、200 × gで20°Cで10〜15分間遠心分離します。遠心分離後、上清を完全に除去します
   手記：このステップにより、PBMC内の不要な血小板が除去されます。この手順を繰り返すことで、血小板を完全に除去することができます。
8. 特定の集団の選択が望ましくない場合は、白血球完全培地(10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンのRPMI-1640培地)で細胞ペレットを再懸濁し、細胞カウントを行った後、10⁷ PBMCsあたり1mlの培地を懸濁してから、次のステップに進みます。

>2. 白血球集団の磁気標識

1. PBMC懸濁液を300 × gで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引します。
2. 細胞ペレットを全細胞10⁷個あたり80 μlのPBSに再懸濁します。
3. 10⁷個の全細胞あたり20 μlの指定磁気ビーズ(すなわち、単球の単離用のCD14磁気ビーズ、Tリンパ球の単離用のCD4磁気ビーズ)を添加します。
4. よく混ぜ合わせ、冷蔵庫で2〜8°Cで15分間インキュベー
トします。
5. 7細胞10個あたり1〜2mlのPBSを加えて洗浄し、300 × gで10分間遠心分離します。
6. 上清を完全に吸引し、500 μlのPBS中に最大10個の⁸細胞を再懸濁します。

3. 白血球亜集団の磁気選択

>注:白血球の特定の集団を細胞表面マーカーで単離するためのさまざまな磁気ビーズセパレーターとカラムが、多くのメーカーから提供されています。単離は、1つまたは少数の正のマーカーに基づく正の選択によって、または望ましくない集団の枯渇後の負の選択によって行うことができます。1つのマーカー(すなわち、ヘルパーTリンパ球のCD4、または単球のCD14)を用いて正の選択を行う一般的なアプローチを以下に概説する。

1. メーカーの指示に従って、分離カラムを含む磁気セパレーターを準備し、プライミングします。
2. 標識されたPBMCのサンプルが入ったチューブを塗布し、製造元の指示に従って、陽性標識細胞画分と非標識細胞画分を採取するための15 mL遠心分離チューブを2本用意します。
3. 細胞数をカウントし、陽性で選択された白血球(すなわち、CD4⁺ Tリンパ球またはCD14⁺細胞)を白血球完全培地に再懸濁し、10⁷細胞あたり1 mLの培地を使用します。

>4. 増殖評価のための白血球のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)染色

>注:CFSEは、in vivoおよびin vitro研究の両方で、免疫学的研究に広く使用されています。私たちのプロトコールは、MSC/PBMC(または他の白血球)相互作用のin vitro研究に最適化されています。CFSE in vitro 標識の実施に伴う一般的な手順は似ていますが、プロトコルの特定の用量とタイミングに違いがある場合があります。これは、多くの要因、すなわち、使用される特定の細胞タイプ、使用される細胞番号によるものであり、これらはCFSE蛍光シグナルの強度に影響を与える可能性があります。

1. CFSEストック溶液(10 mM)をPBSで目的の使用濃度10 μM(CFSE使用溶液)に希釈します。CFSEワーキング溶液で標識するために、10個の⁷細胞(すなわち、PBMCまたはT細胞)を調製します。
2. 300 × gで10分間遠心分離して細胞ペレットを取得し、上清を吸引します。
3. 細胞を温めた(37°C)CFSEワーキング溶液1 mLに穏やかに再懸濁し、細胞を37°Cで10分間インキュベートします。
4. 過剰なCFSEを洗い流すには、10%FBSを含む予冷済み(4°C)RPMI培地10倍(容量比)で細胞懸濁液を希釈します。300 x gで5分間遠心分離することにより細胞を沈殿させ、上清を捨てます。この方法で細胞ペレットをさらに2回洗浄します。
5. 遠心分離により細胞を再ペレット化し、細胞数をカウントします。10⁷細胞(PBMCまたはT細胞)を1 mLの新鮮な予熱白血球完全培地に再懸濁します。

>5. エフェクター抑制アッセイ 活性化CFSE標識エフェクターCD4 ⁺ T細胞上の磁気ビーズ選択MSC誘導免疫調節性白血球

1. 37 °C インキュベーターで 3 mL の MSC 完全培地 (MSC 密度: 25,000 細胞/cm²) に MSC を播種し、37 °C インキュベーターで O/N を結合させます。幹細胞が 80% のコンフルエンスに達するようにします。亜集団の選択に十分な MSC 共培養 PBMC を確保するには、少なくとも 3 枚の 6 ウェルプレートが必要です。
2. 培地を吸引し、ステップ1に従って分離したPBMCを、2.5 x 10⁶細胞/ウェル(細胞密度:250,000白血球/cm²)の6ウェルプレートに3 mLの白血球完全培地で加えます。37°Cのインキュベーターで48-72時間共培養します。
3. セクション 2-3.
   による MSC 誘導性免疫調節性白血球 (すなわち、CD14⁺ 細胞) の磁気ビーズ選択特異的集団 手記：この時点でフローサイトメトリー解析のための細胞内サイトカイン染色を行い、白血球サイトカイン発現プロファイルの変化、すなわちMSCによって調節されるインターロイキン-10-ASの発現を評価することができます。
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4. mLの白血球完全培地(T細胞密度:250,000細胞/cm²)中の24ウェルプレートのセクション2-4に従って生成されたCFSE標識同種CD4⁺ T細胞を、ビーズ選択MSC誘導白血球にさまざまな比率、すなわち1:10、1:5、1:2、および1:1(細胞間)の比率で加えます。
5. CD4⁺ T細胞を刺激するには、α-CD3/28標識マイクロビーズを添加して、ビーズと細胞の比率を1:1にします。
6. ネガティブコントロールの場合は、24ウェルプレート(T細胞密度:250,000細胞/cm²)に500,000 CD4⁺ T細胞/ウェルを1 mLの白血球完全培地のみでプレートします。ポジティブコントロールの場合は、同数のCD4⁺ T細胞/ウェルをプレーティングするだけでなく、α-CD3/28標識マイクロビーズを添加して、ビーズと細胞の比率を1:1にします。
7. 共培養の3^日目に、フルオレセインに適した488 nmの励起および蛍光フィルターを用いたフローサイトメトリー分析により、CFSE標識CD4⁺ T細胞(丸底チューブに配置)の増殖を評価します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フィコール・パケ・プラス	GEヘルスケア	71-7167-00 AGの	末梢血単核細胞(PBMC)の単離のための壮大な密度
Vibrant CFDA-SE セルトレーサーキット (CFSE)	ライフテクノロジー	V12883	細胞分裂検出のための細胞標識
Dynabeads ヒト T-アクチベーター CD3/28	ライフテクノロジー	111.32ダスト	ヒトTリンパ球、例えばCD4+ T細胞、CD8+ T細胞などの活性化
autoMACS™セパレーター	ミルテニーバイオテック	autoMACS™セパレーター	磁気ベースのセルセパレーター
autoMACS® カラム	ミルテニーバイオテック	〒130-021-101	分離カラム
CD14マイクロビーズ、ヒト	ミルテニーバイオテック	〒130-050-201	PBMC由来のCD14+ヒト単球およびマクロファージの正選択
CD4マイクロビーズ、ヒト	ミルテニーバイオテック	〒130-045-101	PBMC由来のCD4+ヒトTリンパ球の正選択
RPMI 1640 ミディアム	ライフテクノロジー	11875	ヒトPBMC/白血球培地
DMEM、低グルコース、ピルビン酸	ライフテクノロジー	11885	ヒト間葉系幹細胞(MSC)培地
L-グルタミン	ライフテクノロジー	〒25030-081	MSC完全培地のサプリメント
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15070-063	PBMC/白血球およびMSC完全培地の補充
ウシ胎児血清(FBS)	1)MSC培養用のHyclone、2)他のすべての細胞(すなわち、PBMC、特定の白血球集団)用のLife Technologies	1) SH30070.03M 2) 10091-148	MSCのin vitro培養を支えるためのプレテストロット
24ウェル細胞培養プレート	コーニング	COR3524	共培養プレート
50 mL遠心チューブ	コーニング	430291	Ficoll-Paque PLUSによる全血からのPBMCの単離
15 mL遠心チューブ	コーニング	430766	ラベル付きセルフラクションとラベルなしセルフラクションのコレクション
丸底チューブ	BDファルコン	352008	フローサイトメトリー解析のための細胞の収集

年 年 。