白血球動員に及ぼす間質細胞の影響に関するIn vitroフロー調査

要約

出典:Munir, H. et al., Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、白血球の動員に対する間質細胞の影響を調査する方法を示しています。パラレルプレートフローチャンバーモデルでは、炎症誘発性サイトカインが内皮細胞による接着受容体の発現を誘導し、好中球の動員と移動を促進します。間質細胞と内皮細胞との間のクロストークは、内皮細胞への好中球動員を減少させます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 初代ヒト内皮細胞および間葉系幹細胞の単離と培養

1. ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単離と培養:
   1. へその緒をペーパータオルでトレイに置き、70%エタノールをスプレーします。ティッシュカルチャーフードに入れます。静脈を特定し、両端でカニューレを挿入します。カニューレの端の周りにケーブルタイを配置して固定します。
   2. 注射器を使用して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で静脈血を洗い流します。シリンジに空気を入れ、静脈を通過して残留PBSを除去および廃棄します。
   3. Ia型コラゲナーゼ10 mg/mLを解凍し、PBS(カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む)で1:10を希釈して最終濃度1 mg/mlにします。clを閉じますamp 両端のカニューレの。
   4. トレイをティッシュで覆い、70%エタノールをスプレーします。コードをインキュベーターに20分間入れ、37°Cおよび5%の二酸化炭素(CO₂)で20分間置きます。
   5. インキュベーターからコードを取り出し、ケーブルタイを締めます。コードを1分間優しくマッサージします。細胞懸濁液を10 mLのPBSで洗い流し、50 mLの遠心チューブに回収します。
   6. シリンジに空気を入れ、静脈を通過して残留PBSを2回除去し、ステップ1.1.5で使用した50mlの遠心分離チューブにPBSを収集します。400 x gで室温(RT)で5分間遠心分離します。
   7. 上清を吸引し、ペレットを1 mLの完全内皮細胞(EC)培地に再懸濁します。EC培地は、M199に35 μg/mlの硫酸ゲンタマイシン、10 ng/mlのヒト上皮成長因子、1 μg/mlのヒドロコルチゾン、2.5 μg/mlのアムホテリシンB、および20%のウシ胎児血清を添加
   したものです。
   8. 4 mlのECメディウムとEC懸濁液を25 cm²フラスコに加えます。メディアは翌日に交換し、その後は2日ごとに交換します。
   9. ECは丸石のような形態を呈します(図1Ai)。接着アッセイの場合、ECは通常、100%のコンフルエンスに達したときに播種されます(セクション1.4を参照)。
2. ヒト臍帯からのウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJMSC)の単離:
   1. ウォートンのゼリー由来MSC(WJMSC)を新鮮な臍帯またはECの分離にすでに使用されている臍帯から分離します。各ピースを縦方向に切断して、血管(2つの動脈[白、硬直]と1つの静脈[黄色、膨張])を明らかにします。
   2. 滅菌ハサミと鉗子を使用して血管を切除し、廃棄します。すべてのティッシュを2〜3mm^の3ピースにカットします。鉗子を使用して、2〜3 mm³個を50 mlの遠心分離チューブに入れます。
   3. ストックコラゲナーゼII型100 mg/mlを解凍し、10 mL PBSで1:100を希釈して最終濃度を1 mg/mlにします。ストックヒアルロニダーゼ20,000 U/mlを解凍し、コラゲナーゼ溶液中で最終濃度50 U/mlまで1:400に希釈します。
   4. 組織片が入った遠心チューブに酵素カクテルを加えます。組織片を低速ローテーターで37°Cで5時間インキュベートします。
   5. 細胞懸濁液をPBSで1:5に希釈します。100 μmのポアフィルターを新しい50 mL遠心分離チューブに入れます。細胞懸濁液を100 μmのポアフィルターに注ぎます.
      手記：残りの組織片はフィルターに保持され、細胞は 50ml の遠心分離チューブに収集されます。
   6. フィルターを廃棄します。細胞懸濁液を400 x gで10分間遠心分離し、上清を吸引し、WJMSCペレットを12 mLの完全WJMSC培養培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium、DMEM低グルコース、10%子牛胎児血清(FCS)および100 U / mlペニシリン+ 100μg / mlストレプトマイシンミックス)に再懸濁します。
   7. 75 cm²組織培養フラスコにすべての細胞を播種します。24時間後に培地を12 mLの完全WJMSC培地と交換します。2〜3日ごとに培地を交換してください。細胞は2週間以内に70〜80%のコンフルエンスに達するはずです。WJMSCが70〜80%の合流点に達したときの通過(セクション1.4を参照)。
3. 骨髄由来MSC(BMMSC)の拡大:
   1. 前述のように、ヒト骨髄由来MSC(BMMSC)を単離します。10 mLの予熱間葉系幹細胞、MSC増殖培地(MSCGM)を15 mLの遠心チューブに加えます。
   2. p2 BMMSCのバイアルを37°Cの水浴に2分間入れて解凍し、BMMSC懸濁液をMSCGMを含む遠心分離チューブに加えます。ピペッティングでよく混ぜます。
   3. 400 x gでRTで5分間遠心分離し、上清を完全に吸引します。
   4. 細胞を1 mLのMSCGMに再懸濁し、血球計算盤またはセロメーターなどのデジタルセルカウンターを使用して細胞をカウントします。
   5. 12 mL MSCGM中、5,000〜6,000細胞/cm²の密度で75 cm²培養フラスコに細胞を播種します。24時間後に12 mlMSCGMで培地を交換します。.2〜3日ごとに12mlのMSCGMを細胞に供給します。
   6. BMMSCが70〜80%の合流点に達したときの通過(セクション1.4を参照)。細胞は線維芽細胞性の形態を示します(図1Aii)。
4. ECとMSCの分遣隊:
   1. 25 cm²培養フラスコから培地を吸引します。0.02%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を2 mLで約2分間加えます。EDTAを吸引し、2 mlのトリプシン(2.5 mg / ml)を追加します。.細胞が丸くなるまで顕微鏡で観察します。
   2. フラスコをタップしてセルを切り離します。8 mLの培地(細胞タイプによって異なります)を追加してトリプシンを不活性化します。HUVEC の EC 培地、WJMSC の DMEM LG、BMMSC の MSCGM) を培養フラスコに入れ、懸濁液を 15 ml の遠心分離チューブに移します。
   3. RTで400 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引し、以下に説明するようにペレットを再懸濁します。
      1. MSCの継代のために、ペレットを3 mLの培地に再懸濁します。11 mLの培地を3つの別々の75 cm²培養フラスコに加えます。各培養フラスコに1 mLの細胞懸濁液を添加します(1:3分割)。WJMSCおよびBMMSCを3回(p3)継代してから、共培養アッセイに使用してください。
      2. 接着アッセイにおけるECまたはMSCのシーディングについては、セクション2および3を参照してください。
5. MSCの凍結:
   1. パッセージ3で、セクション1.4で説明されているようにMSCを切り離します。上清を吸引し、氷冷した3 mLのCryoSFMに再懸濁します。細胞懸濁液の1mlアリコートを1.5mlの氷冷クライオバイアルにピペットで移します。クライオバイアルを冷凍容器に入れます。
   2. 容器を-80°C O / Nで保管し、液体窒素に移します。MSCのバイアルを解凍します(手順1.3.1〜1.3.6に従います)。MSCを5 mLの培地に再懸濁し(WJMSCまたはBMMSCに適した培地を選択)、25 cm²フラスコに播種します。

>2. フィルター上での内皮間葉系幹細胞共培養の確立

1. セクション1.4の説明に従って、WJまたはBMMSCを切り離します。ペレットを1mlのMSCGMに再懸濁します。血球計算盤またはセロメーターを使用して細胞数をカウントします。
2. 最終濃度が500 μlのMSCGM中5 x 10⁵ MSCになるように容量を調整してください。
3. 滅菌鉗子を使用して、6ウェル、0.4μmのPETトランズウェルフィルターを反転させ、滅菌ボックスに入れます。
4. 5 x 10⁵ MSCをフィルターの外面に播種します。フィルターを37°Cおよび5%CO₂で1時間インキュベートします。
5. フィルターの外面からメディアを収集します。メディア中の非接着性MSCの数をカウントします。滅菌鉗子を使用してフィルターを再反転し、3 mL MSCGMを含む対応する6ウェルプレートに入れます。
6. フィルターの内面に2 mlのMSCGMを加えます(図1B)。37°C、5%_CO2のインキュベーターに24時間置く。ECのコンフルエントな25cm2フラスコをトリプシンします(図1Ai;セクション1.4として)。
7. ECを8 mL MSCGMに再懸濁します(1 x 25cm²フラスコで4つの6ウェルフィルターを播種します;~5 x 10⁵ EC /フィルター)。多孔質フィルターの上部と下部から媒体を吸引します。3 mLの新鮮なMSCGMを下部チャンバー(フィルターの下)に加えます。各フィルターの内面に2mlのEC懸濁液を追加します。37°Cおよび5%CO₂で1時間インキュベートします。
8. 培地を吸引して非付着性のECを洗い流し、新しいMSCGMと交換します。最初にMSCを播種せずに内面に細胞を播種することにより、平行EC単一培養フィルターをセットします。O/Nを37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。
9. EC単層がコンフルエントであり、ギャップが含まれていないことを確認します。サブコンフルエントな単分子膜は、接着アッセイには使用できません(図1B)。
10. 1 x 10⁵ U/ml ストック腫瘍壊死因子-α (TNFα) を解凍し、MSCGM で 1:1,000 を希釈して最終濃度 100 U/ml (~10 ng/ml に相当) にします。100 U/ml TNFαをMSCGMで1:10に希釈して段階希釈を行い、10 U/mlを得ます。10 U/ml TNFαをMSCGMで1:10に希釈して、1 U/mlを得ます。
11. アッセイの前に、フィルターの上部チャンバーと下部チャンバーを 1、10、または 100 U/ml TNFα (~10 ng/ml に相当) で 37 °C で 4 時間処理します。

3. 白血球の単離

1. 健康なボランティアから静脈血を採取し、すぐにEDTAチューブに分注します。チューブを静かに反転させて混ぜます。
2. 2.5 mLのHistopaque 1077を2.5 mLのHistopaque 1119に10 mLの丸底チューブで重ねます。全血5 mlをHistopaqueグラデーションに重ねます。800 x gで40分間、室温で遠心分離します。
3. Histopaque 1077 と 1119 の界面 (赤血球層の上) で末梢多形核好中球 (PMN) を採取します。10mlの丸底チューブに入れ、PBSAで10mlにメイクします。チューブを静かに反転させ、400 x gでRTで5分間遠心分離します。
4. 7.5% BSA溶液を100 mL PBS(カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む)で1:50に希釈し、最終濃度0.15%(w / v;PBSA)。上清を吸引し、10 mLのPBSAに再懸濁します。400 x gでRTで5分間遠心分離します。
5. 1 mLのPBSAに再懸濁します。細胞懸濁液のアリコート20 μlを取り、PBSA380 μL(1:20希釈)に加えます。血球計算盤またはセロメーターを使用して細胞をカウントします。PBSAで必要な濃度(トランズウェルフィルターおよびイビディマイクロスライドの場合は1 x 10⁶ / ml)に希釈します。アッセイまでRTで好中球懸濁液を維持します。

4. フローシステムの組み立て

1. 図 1C に示すように、フロー・システムをセットアップします。ヒーターの電源を入れ、37°Cに設定し、20mlのシリンジ(プランジャーを取り外す)と5mlのシリンジを3方向タップに取り付けます。マイクロポアテープを使用してタップをパースペックスチャンバーに取り付けます。
2. バルブと3方向タップの間の距離にほぼ近いシリコン2/4mm(厚さ)の長いシリコンチューブを測定して切断します。長さ8〜10mmの1/3mm(細い)チューブをカットし、太いチューブの一方の端に挿入します。太いチューブ側を3ウェイタップに取り付けます。
3. 細いチューブの端を電子3ウェイマイクロバルブのポートに接続します。これが「ウォッシュリザーバー」です。長さ6〜8mmの太いチューブと細いチューブをカットします。
4. 細いチューブを太いチューブの一方の端に挿入します。太いチューブの端を2mlのシリンジに取り付けます(プランジャーを取り外します)。
5. 2 mLシリンジの細いチューブ端を電子マイクロバルブのポートに接続して、「サンプルリザーバー」を作成します。マイクロバルブと顕微鏡ステージの中心との間の距離である細いチューブの長い部分を測定して切断することにより、バルブをフィルターフローチャンバーに接続します。
6. マイクロスライドモデルの場合は、細いチューブの端に8〜10mmの太いチューブを取り付けます。太いチューブの端にL字型コネクタを配置します。これがマイクロスライドに接続されます。フィルターモデルの場合、細いチューブの端にチューブを接続する8〜10mmのPortexブルーラインマノメーターを取り付けます。
7. 細いチューブの端をマイクロバルブに置きます。これは、洗浄リザーバーとサンプルリザーバーの一般的な出力です。リザーバーにPBSAを充填します。PBSAを流してチューブをプライムし、気泡を取り除きます。
8. マノメーターチューブを29 mm(50 ml)ガラスシリンジに取り付けます。シリンジに10mlのPBSAを充填してプライミングします。チューブに接続されている端が上を向くようにシリンジを反転させ、すべての気泡を押し出します。5mlのPBSAを補充します。
9. マイクロスライドモデルの場合のみ、ガラスシリンジにつながるマノメーターチューブの端に10〜12mmの厚さのチューブを取り付けます。L字型のコネクタを太いチューブの端に配置します。ガラスシリンジをシリンジポンプに入れて、注入/回収します。.
10. 0.1 Pa(トランズウェルフィルター)または0.05 Pa(同上マイクロスライド)の所望の壁せん断応力(Pascal、Paのτ_w)を生成するために必要な補充流量(Q)を、次の式を使用して計算します:
    γ_w = (6.Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    ここで、w = 内部幅、h = 流路の内部深度。n =流れる溶液の粘度。PBSAはn = 0.7 mPa.sです。平行板フィルターフローチャンバーの場合、幅(w)は4mm、深さ(h)は0.133mmです。チャンバーの深さは、使用するパラフィルムガスケットの厚さの違いにより、わずかに異なる場合があります。Ibidi マイクロスライドの場合、幅は 3.8 mm、深さは 0.4 mm
    手記：流路の寸法とキャプチャダイナミクスの違いにより、マイクロスライドモデルにはフィルターモデルとは異なるせん断応力を使用します。

5. フィルターを組み込んだ平行平板フローチャンバーのセットアップ

1. パラフィルム(ガラスカバースリップと同じサイズ)を金属テンプレートを使用してカットします。パラフィルムの20 x 4 mmのスロットを切り取ります(流路を作成するため)金属テンプレートを使用します。ガスケットを使用して、ガラスカバースリップの流路に印を付けます。
2. 6ウェルフィルターの端をガラスカバースリップに合わせます。フィルターが流路のマーキングを覆っていることを確認します。10Aタイプのメスを使用してフィルターを慎重に切り取ります。
3. フィルターをパラフィルムガスケットで慎重に覆い、流路スロットがフィルターの中央にあることを確認します(図1D)。清潔なティッシュペーパーを使用して、気泡を押し出します。
4. カバースリップをパースペックスフローチャンバーの底板のくぼみに置きます。上部のパースペックスプレートをガスケットの上部に合わせ、プレートをねじ込みます(図1D)。
5. 3方向タップを回して、ウォッシュバッファー(PBSA)がバルブを流れるようにします。マノメーターチューブを上部パースペックスプレートのインレットポートに接続します。PBSAを流路に通して、気泡が通過できるようにします。
6. シリンジポンプからの圧力計チューブをパースペックスプレートの出口ポートに接続します。シリンジポンプを補充するように設定し、実行を押します。チャンバーの上部プレートに滴り落ちたPBSAを清掃します。
7. チャンバーを倒立位相差顕微鏡のステージに置きます。フォーカスを調整して、フィルターの上のECを視覚化します(図1B)。

6. 内皮細胞に対する白血球の灌流

1. 精製した好中球2mlをサンプルリザーバーに入れ、2分間温めます。
2. バルブをオンにして、内皮に好中球を灌流します。好中球ボーラスを4分間送達します。バルブをオフにし、実験の残りの部分で洗浄リザーバーからPBSAを灌流します。
3. アッセイ中のどの時点でも気泡が流路を通過しないようにしてください。これによりEC単分子膜が破壊され、付着した好中球が剥離します。

7. 好中球の捕捉と振る舞いの記録

1. 好中球の流れ中または灌流後のいずれかで好中球の動員を記録します。
2. フローチャネルの中央にある少なくとも5〜10フィールドのすべてのデジタル録音を行います。インレットポートで対物レンズをチャネルの端に移動し、ポートの中央を特定することにより、チャネルの中心を特定します。
   1. 好中球の流れ中に記録するには、10秒ごとに1つのフィールドの画像を1分間撮影し、チャネルに沿って移動し、別のフィールドを1分間記録します。ボーラスの期間中繰り返します。.
   2. 灌流後の記録では、白血球の挙動を評価するために、流路の中央に5〜10のフィールドを10秒間記録します(通常は好中球ボーラスの終了から2分後)。10秒間隔で毎秒画像を撮影します。これにより、流れからの捕捉と付着性好中球の挙動を解析するのに十分な時間を確保できます。
   3. 少なくとも 10 人の転生した好中球を含む 1 つのフィールドを 5 分間記録し、30 秒ごとに画像を撮影します。これを使用して、遊走細胞(内皮の上または下)の速度を計算できます。
   4. 別の一連の 10 秒フィールドを記録します (通常は灌流後 9 分)。これにより、好中球が内皮単分子膜を通過する時間を確保できます。
   5. シリンジポンプを停止し、チューブを取り外します。フローチャンバーを分解し、サンプルリザーバーとチューブをすすぎます。後続のフィルター/マイクロスライドチャンネルについても繰り返します。

>8. 白血球の動員と行動の解析

1. 2 分間の時点での 10 秒間の記録中に、各フィールドの好中球の数をカウントします。カウントするには、すべてのセルが 1 秒のフィールドに存在する必要があります。視野の 2 つの側面 (上/右の境界線など) のフィールドに部分的に存在するセルは、10 秒間フィールドに留まる限り、カウントに含まれます。
2. フィールドごとの接着性好中球の平均数を計算します。記録されたフィールドの長さと幅を測定します。フィールドの面積を計算します。1 mm²にいくつのフィールドがあるかを計算します。平均好中球数に1 mm²のフィールド数を掛けます。
3. 灌流した好中球の量(例:2 x 10⁶/ml*Q [例:平行プレートフローチャンバーの場合は0.0999 ml/min])にボーラスの持続時間(例:4分)を掛けて、灌流した好中球の総数を計算します。
4. 好中球数/mm²を灌流した好中球の総数で割って、接着した細胞の総数を決定します(接着細胞/ mm² / 10⁶灌流)。
5. 付着した好中球が転がっているか、しっかりと付着しているか、または転生しているかを評価します。
   1. ローリング好中球は位相が明るく、内皮単分子膜に沿ってゆっくりと移動します(1〜10μm/秒)。
   2. しっかりと接着した細胞は、位相が明るくEC表面に結合しており、静止している(つまり、記録中に動かない)か、形状が変化してEC表面上を移動しています(図1Ei)。
   3. 転生した好中球は相が暗く、EC層より下にあります(図1Eii)。
6. 転がっている、静止している、および転生している接着細胞の割合を計算します。あるいは、好中球の挙動は、総接着の計算に使用したのと同じ式を適用することにより、異なる挙動を示す総細胞数として表すことができます(ステップ8.6〜8.7で説明)。
   1. ローリング好中球の前縁をマークします。同じセルの先頭エッジを 10 秒シーケンスの最後にマークします。2 つのポイント間に線を引き、セルが移動した距離を計測します。
   2. この値を、セルがローリングしている記録の期間 (つまり、10 秒) で割ります。10秒の間隔全体にわたってフィールドにいる好中球を選択してみてください。
7. 好中球が表面上を移動する速度(形を変えた位相が明るい)または内皮の下を移動する速度(位相が暗い)を計算するには、5分間の記録を使用します。
   1. シーケンスの先頭に移行セルのアウトラインを描画し、シーケンス全体での移動を追跡します。各セルの 1 分間隔ごとの重心の X 位置と Y 位置をメモします。シーケンスの最初のイメージの X 位置と Y 位置の値を、2 番目のイメージの値から減算します。これはピタゴラスの定理に基づいています。
   2. 3 番目の画像から 2 番目の画像の値を減算します。シーケンス内のすべての画像に対してこれを行います。X 値と Y 値を 2 乗し、合計します。
   3. 結果の値である平方根。各分間隔で計算された速度を平均化して、各セルの速度を計算します。トラック10は移動した好中球を移動させ、平均速度を計算します。

結果

図 1.EC-MSC共培養の確立とフローベース接着アッセイを用いた好中球動員の解析 (A)組織培養フラスコで増殖させた(i)一次ECおよび(ii)Passage 3 BMMSCの顕微鏡写真 (B)6ウェルトランズウェルフィルターインサートで培養したECおよびMSCの顕微鏡写真 (C)フロー生成に使用した灌流システムの図(D) (E) 100 U/ml TNFα で刺激されたフローから EC への動員後の (i) しっかりと付着した (FA) および (ii) 転生した (TM) 好中球の顕微鏡写真。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラゲナーゼIa	シグマ	C2674	10ml PBSで希釈して最終濃度を10 mg / mlにします。
ダルベッコのPBS	シグマ	D8662	カルシウムと塩化マグネシウムを使用。滅菌し、室温で保存してください。
1X ミディアム M199	ギブコ	〒31150-022	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください。
硫酸ゲンタマイシン	シグマ	G1397	4°Cで保存し、M199 500mlボトルに加えます。
ヒト上皮成長因子	シグマ	E9644	-20°Cで10μlのアリコートで保存してください。
子牛胎児血清(FCS)	シグマ	F9665	FCSは、分離されたECの成長と生存率を確認するためにバッチテストする必要があります。56°Cで熱不活性化します。-20°Cで10mlのアリコートで保存します。
アムホテリシンB	ギブコ	15290-026	強力で、1週間以内に有毒になるため、毎週新鮮な完全なHUVEC培地を作成する必要があります。-20°Cで1mlのアリコートで保存してください。
ヒドロコルチゾン	シグマ	H0135-J	ストックはエタノールです。-20°Cで10μlのアリコートで保存してください。
コラゲナーゼII型	シグマ	C6885	PBSのストック液を最終濃度100mg/mlに希釈し、100μlのアリコートで-20°Cで保存します。
ヒアルロニダーゼ	シグマ	H3631-J	PBSのストックを最終濃度20,000U/mlに希釈し、100μlのアリコートで-20°Cで保存します。
100μmセルストレーナー(50mlセンチフュージチューブ用	科学ラボ用品(SLS)	352360	他の市販のセルストレーナー(例:Greiner bio-one)も使用できます。
DMEM低グルコース	バイオセラ	LM-D1102/500	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください。
ペニシリン/ストレプトマイシンミックス	シグマ	P4333	-20°Cで1mlのアリコートで保存してください。
25cm2組織培養フラスコ	SLSの	353109
75cm2組織培養フラスコ	SLSの	353136
骨髄間葉系幹細胞バイアル	ロンザ	PT-2501	到着後は液体窒素で保存してください。セルは到着時には継代 2 にありますが、継代 0 に指定されています。通路3にExapanドし、後で使用するために液体窒素で保存します。
間葉系幹細胞増殖培地(MSCGM)	ロンザ	PT-3001	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください。Cell Tracker Green染色には、FCSを含まない培地を使用してください。
EDTA(0.02%)ソリューション	シグマ	E8008	4°Cで保存し、37°Cのウォーターバスで温めてから使用してください。
トリプシン溶液	シグマ	T4424	-20°Cで2mlのアリコートで保存してください。室温で解凍し、すぐに使用してください。
クライオバイアル	グライナーバイオワン	2019年02月	細胞懸濁液を追加する前に、追加する前に氷上に保管してください。
Mr.フロスティ冷凍コンテナ	ナルゲン	〒5100-0001	室温で保存してください。細胞にクライオバイアルを添加する場合は、細胞を液体窒素に変換する前に、-80°Cで24時間保存してください。
セルトラッカーグリーン色素	ライフテクノロジー	C2925	5μlのアリコートで-20°Cで保存し、予熱した5ml(37°C)MSCGMで希釈します。
細胞計数チャンバー	ネクセロム	SD-100	あるいは、血球計算盤を使用することもできます。
セロメータ自動T4セルカウンター	ネクセロム	オートT4-203-0238
腫瘍壊死因子α(TNFα)	R&Dシステム	210-TA-100	PBSのストックを最終濃度100,000U/mlに希釈し、-80°Cで10μlのアリコートで保存します。
6ウェル、0.4μm PETトランズウェルフィルター	SLSの	353090
K2-EDTA(10mlチューブ入り)	ザルシュテット		室温で保存してください。
ヒストパケ1119	シグマ	11191	4°Cで保存し、室温まで温めてから使用してください。
ヒストパケ1077	シグマ	10771	4°Cで保存し、室温まで温めてから使用してください。
10ml丸底チューブ	アップルトンウッズ	SC211 142 AS (英語
7.5% BSAフラクションVソリューション	ライフテクノロジー	15260-037	4°Cで保存してください。
20mlプラスティパックシリンジ	BDファルコン	300613
5mlプラスティパックシリンジ	BDファルコン	302187
2mlプラスティパックシリンジ	BDファルコン	300185
3M低アレルギー性サージカルテープ9m×2.5cm	ミクロポア	1530年1	シリンジタップをパースペックスチャンバーの壁に固定するために使用します。
シリコンゴムチューブ、内径/外径(ID/OD)1/3mm(細管)	フィッシャーサイエンティフィック	FB68854	シリコンチューブを適切なサイズにカットします。電子マイクロバルブに直接つながるすべてのチューブは細くなければなりません。
シリコンゴムチューブ ID/OD 2/4mm (太いチューブ)	フィッシャーサイエンティフィック	FB68855
Portexブルーラインマノメーターチューブ	スミス	200/495/200	シリンジポンプにつながるチューブ。
3方向ストップコック	BOCオーメダAB
ポンプ用ガラス50mlシリンジ	ポッパーマイクロメイト	550962	使用前に気泡を取り除き、プライミングする必要があります。
ガラスカバースリップ	レイモンド・A・ラム		26x76mmカバースリップはオーダーメイドです。ロット番号2440980。
パラフィルムガスケット	アメリカン・ナショナル・キャン・カンパニー		26x76mmのパラフィルムをアルミテンプレートでカットし、メス10aで20x4mmのスロットをカットします。ガスケットの厚さは約133μmです。
2つのパースペックス平行プレート	ウォルフソン応用技術研究所		8本のネジで固定された平行なプレートで構成される特別に設計されたチャンバー。下部プレートには、中央に切り取られた表示スロットと、カバーガラス、フィルター、ガスケット用のスペースを確保するためにフライス加工された浅いくぼみがあります。上部パースペックスプレートには、流路上に配置された入口と出口の穴があります。
最小デッドスペースを備えた電子3ウェイマイクロバルブ	リープロダクツ株式会社	LFYA1226032H	12ボルトのDC電源に電子的に接続されています。
輸液/回収用シリンジポンプ (PHD2000)	ハーバード大学装置	70-2001	直径を29mmに設定し、詰め替え(流量)速度を設定します。
L字型コネクタ	ラブート	LE876	イビディマイクロスライドチャネルのインレットポートとアウトレットポートに取り付けます。
ビデオカメラ	Qイメージング	01-QIC-F-M-12-C	digitallビデオを録画できるコンピューターに接続されています。
イメージプロプラス 7.0	メディアサイバネティックス	41N70000-61592	データ分析のため。さまざまな動作を表示するセルに手動でタグを付けます。ローリング速度と移動速度を解析するためのセルの追跡。

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