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1. がん培養細胞における化学療法薬による老化誘導
>注:このセクションのすべての細胞操作ステップは、無菌の慣行を使用してバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。このセクションは、接着細胞タイプについて書かれています。懸濁細胞は、注記されたように適切な修飾を施して使用してもよい。
- 使用した特定の細胞株を提供したサプライヤーまたは研究所からの標準プロトコルに従って、がん細胞株を増殖させます。
手記：低継代細胞(p < 10)は、未処理の細胞サンプルで複製老化のレベルが低い、つまりバックグラウンドが低いため、一般に好まれます。
- 薬物による老化誘導の1日前に、トリプシン-EDTA 0.25%(または推奨)で細胞を採取します。等量の完全な培養培地を添加してトリプシンを中和し、細胞懸濁液を滅菌コニカルチューブに移します.
手記：このステップは、浮遊細胞には必要ありません。
- 標準的な血球計算盤法を使用して細胞をカウントし、細胞数/mLを記録します。標準的な6ウェルプラスチック培養皿中の1 × 103-10 × 103細胞/cm2のプレートセル
手記：最適なめっき密度は細胞の増殖速度に依存するため、ユーザーが決定する必要があります。細胞は、処理時(すなわち、プレーティング後18-24時間のインキュベーション後)に約10%〜20%のコンフルエントで対数期増殖している必要があります。浮遊細胞の開始密度(細胞数/mL)は、ユーザーが決定する必要があります。通常、6ウェルプレートでは、1つの標準的なフローサイトメトリー分析サンプルに対して、ウェルあたり十分な老化細胞が得られます。フローソーティングを行う場合は、はるかに大きな表面積(複数のP150プレートなど)を使用して、ダウンストリームアッセイに十分な数の老化細胞を回収できるようにする必要があります（≥1 × 106)。
- めっき細胞を37°Cのインキュベーターで一晩(18-24時間)インキュベートし、5% CO2と湿度鍋でインキュベー
トします。
- めっき細胞を老化誘導化学療法薬で治療します。少なくとも1つのポジティブコントロール、例えば、エトポシド(ETO)またはブレオマイシン(BLM)を含めます。薬剤ごとに重複するウェルを準備します。コントロールとして車両のみで扱われた1セットを含めます.
手記：各実験薬の用量曲線は、使用する細胞株における老化誘導の最適な濃度を決定するために、ユーザーがテストする必要があります。
- 37°Cのインキュベーターで、5% CO2と湿度パンを使用して細胞を4日間インキュベートし、老化を開始します。光学顕微鏡を使用して、予想される形態の変化を毎日調べます.
手記： 老化の発症率によっては、3〜5日のインキュベーション時間が許容される場合があります。必要に応じて培地を交換し、薬剤を再塗布する(または再適用しない)ことで、老化細胞の許容可能な割合を達成しながら健康な増殖条件を促進することができます。
- 老化の開始後、トリプシン-EDTA 0.25%を37°Cで5分間添加して細胞を回収します。細胞が懸濁液に解離したら、等量の完全な培地でトリプシンを中和します。
手記： このステップは、懸濁液中で増殖する細胞には必要ありません。表面マーカー染色を行う場合は、細胞上の表面抗原を一時的に破壊する可能性があるため、トリプシン-EDTAの使用は避けてください。代わりに、滅菌プラスチックセルスクレーパー(または表面抗原を保存するように設計された別の解離試薬)を使用して、単層を穏やかに解離します。
- 血球計算盤を使用して各サンプルの細胞をカウントします。各サンプルの細胞数/mLを計算します.
手記： トリパンブルーを添加して、この時点での死細胞の割合(すなわち、薬物治療によるもの)を評価することができますが、細胞死はDDAOG染色ワークフロー中に蛍光生存率色素で決定することもできます。
- 分注≥0.5 × 106細胞/サンプルを1.7 mL微量遠心チューブに入れます.
手記： サンプルあたりの細胞数は、すべてのサンプルで標準化する必要があります。
- チューブを1,000 × gで5分間遠心分離し、4°Cの微量遠心分離機で上清を取り除きます。
手記：冷蔵マイクロ遠心分離機が利用できない場合は、特定の回復力のある細胞タイプに対して周囲温度で遠心分離を行うことが許容される場合があります。
- セクション2のDDAOG染色に進みます。
2. 細胞サンプル中のSA-β-GalのDDAOG染色
- 1 mM Bafilomycin A1 stock を 1:1,000x で DMEM 培地 (FBS なし) に希釈し、最終濃度を 1 μM にします。
- 調製したBaf-DMEM溶液を細胞ペレットサンプル(ステップ1.11から)に添加し、1 × 106細胞/mL.
手記：例えば、サンプルあたり0.5×10個の6細胞を使用する場合は、0.5mLのBaf-DMEMを添加します。
- 低速にセットしたローテーター/シェーカーで37°C(CO2なし)で30分間インキュベートします
手記：染色プロセスでは、溶液を酸性化し、それによってBafおよびDDAOG染色を妨げる可能性のあるCO2インキュベーターは避けてください。
- 洗浄せずに、DDAOGストック溶液(5 mg/mL)を1:500x(最終10 μg/mL)で各サンプルに加えます。ピペットで混ぜます。ローテーター/シェーカーを37°C(CO2なし)で60分間交換します。直射日光から保護してください。
- チューブを1,000 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。
- チューブとピペットで混合するために、1 mLの氷冷した0.5% BSAで洗浄します。チューブを1,000 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。このステップを2回繰り返して、細胞を徹底的に洗浄します。上清を取り除き、次に進みます.
手記： ステップ2.6の洗浄ステップを実行して、望ましくない蛍光発光(460/610 nm)を示す可能性のある未切断のDDAOGを除去することが重要です。
- (オプション)DDAOG染色細胞の固定と保存、後の分析用
- 0.5 mLの氷冷した4%パラホルムアルデヒドを各洗浄サンプルに滴下します。ピペットで混ぜます。
- 室温で10分間インキュベートします。
- 細胞を1mLのPBSで2回洗浄します。
- サンプルは、フローサイトメトリー解析の前に4°Cで最大1週間保存してください.
手記：固定サンプルの場合は、ステップ2.8をスキップします。
- Calcein Violet 450 AMストック(1 mM)を1:1,000倍で1% BSA-PBS(最終1 μM)に希釈します。ステップ2.6で洗浄した細胞ペレットに300 μL(培養細胞サンプル用)を加えます。暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。
- フローサイトメトリーのセットアップ(セクション3)に進みます。
>3. フローサイトメーターのセットアップとデータ取得
- 細胞サンプルをフローサイトメトリー装置と互換性のあるチューブに移します。チューブを氷の上に置き、光から保護します。
手記：細胞懸濁液中に凝集体が観察された場合は、分析前に懸濁液を70〜100μmの細胞ストレーナに通します。40μmのストレーナは、より大きな老化細胞の一部を除外する可能性があるため、使用しないでください。
- 参照されているソフトウェア(材料の表を参照)で、次のプロットを開きます:1)FSC-AとSSC-Aのドットプロット、2)紫色チャネルヒストグラム、3)遠赤色チャネル(APC-Aなど)と緑色チャネル(FITC-Aなど)のドットプロット
手記：ダブレット除外プロットとシングルチャネルヒストグラムも使用できますが、厳密には必須ではありません。
- サイトメーターデータ取得を開始します。
- DDAOGで染色した車両専用コントロールサンプルを吸気ポートに置きます。低い吸気速度で、サンプルデータの取得を開始します。
- FSC 電圧と SSC 電圧を調整して、イベントの >90% がプロットに含まれるようにします。セルがプロットにうまく収まらない場合は、面積スケーリング設定を0.33〜0.5単位に下げます。
- データを記録せずに車両のみのサンプルを削除します。
- (オプション)レインボーキャリブレーションマイクロスフェアの液滴1滴を、PBS1 mLの入ったサイトメーターチューブに加えます。チューブをサイトメーターのインテークポートに置きます。サンプルデータの取得を開始します。
- 紫色、緑、および遠赤のチャネル電圧を調整して、レインボーマイクロスフィアの上部ピークが各チャネルの相対蛍光の104〜105単位の範囲にあり、各チャネルですべてのピークが十分に分離されるようにします。10,000のイベントを記録します。チューブを取り外します。
- DDAOGで染色したポジティブコントロールサンプル(BLM、ETOなど)をインテークポートに置きます。低速でサンプルデータを取得します。FSC、SSC、紫、緑、遠赤のチャンネルでイベントを観察し、イベントの90%以上がすべてのプロットに含まれていることを確認します。車両のみの制御と比較して、AF信号とDDAOG信号の増加に注意してください。
- ソーティングサイトメーターを使用している場合は、このステップでソーティングを開始してください。
- 記録保持の目的で、コントロールサンプルと各ソートサンプルの10,000個のセルを記録します。
- 所望の量の細胞(≥1×106が適切)を、3〜5 mLの培地を入れた装置に適した収集チューブに選別します。
- 選別後、下流の培養または分析に進みます.
手記：本明細書で用いるキャリブレーション済みフローサイトメーターでは、最適なチャンネル電圧は通常250〜600(ミッドレンジ)に低下しますが、最適な電圧およびチャンネル電圧範囲は装置によって異なります。電圧の使用は避けてくださいtages非常に低いまたは高い範囲で、信号を抑制したりノイズを増幅したりする可能性があります。
- 手順3.1〜3.5を完了し、必要に応じてサイトメーターの設定を調整した後、すべてのサンプルのデータを記録します。すべてのサンプル録音で設定が統一されていることを確認してください。培養細胞サンプルあたり≥10,000イベントを記録.
手記：ゲーティングと解析はデータ取得ソフトウェア(FACSDivaなど)を使用して実行できますが、取得後に別の解析ソフトウェア(FlowJo)を使用して実施する完全なゲーティングと解析ワークフローについては、以下のセクション4で説明します。サイトメーターワークステーションでの時間を短縮し、専用の解析ソフトウェアに含まれる追加ツールを活用するために、取得後の解析が推奨されます。
- サンプルデータを.fcsファイル形式で保存します。フローサイトメトリー解析ソフトウェア(FlowJoなど)を搭載したワークステーションコンピューターにファイルをエクスポートします。
4. フローサイトメトリーデータ解析
>注:提示されているワークフローはFlowJoソフトウェアを使用しています。このセクションで説明する主要な手順に同様に従う場合は、別のフローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを使用できます。
- FlowJoソフトウェアを使用して、手順3.7の.fcsデータファイルを開きます。
- レイアウトウィンドウを開きます。
- すべてのサンプルをレイアウトウィンドウにドラッグアンドドロップします。
- 生細胞をゲートします。
- まず、車両専用コントロールのサンプル データをダブルクリックして、データ ウィンドウを開きます。
- データを紫色チャネル ヒストグラムとして視覚化します。CV450で染色された生細胞は、死細胞よりも明るい蛍光に基づいて同定します。
- シングルゲートヒストグラムツールを使用してゲートを描画し、生細胞のみを含めます。ゲートに viable という名前を付けます。
- 次に、サンプルレイアウトウィンドウから、生存ゲートを他のセルサンプルにドラッグして、ゲートを均一に適用します。
- レイアウトウィンドウで、すべてのサンプルをバイオレットチャネル(生存率)ヒストグラムとして可視化します。先に進む前に、サンプル間で生存細胞のゲーティングが適切であることを確認してください。そうでない場合は、必要に応じて調整してください.
手記： 生存率染色は、処理によって異なることがあります。
- 老化細胞をゲートします。
- ビークル専用コントロールのゲート付き生存細胞データをダブルクリックして、そのデータ ウィンドウを開きます。
- データを遠赤遠チャネル (DDAOG) と緑チャネル (AF) のドット プロットとして視覚化します。
- 四角形ゲートツールを使用してゲートを描画し、DDAOG+ と AF+ のセルの <5% を含めます (右上の象限)。ゲートに senescent という名前を付けます。
- 次に、サンプルレイアウトウィンドウから、老化ゲートを他の細胞サンプルの生存可能なサブセットにドラッグして、ゲートを均一に適用します。
- レイアウトウィンドウに、セクション4.4でゲートされたすべての生存可能セルサブセットをドラッグアンドドロップします。すべての生存可能なサンプルを、遠赤(APC-Aなど)と緑チャネル(FITC-Aなど)のドットプロットとして視覚化します。
- ステップ 4.5.3 で描画した老化ゲートがすべてのプロットに表示され、車両のみの制御のゲートが ≤5% から 10% の老化細胞を示すことを確認します。
- 上記の手順で老化細胞の割合を決定したら、FlowJoプロットを使用して結果のデータを提示し、データテーブルに要約するか、標準ソフトウェアを使用して統計的に分析します。