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1. 試薬の調製
- 胆汁酸塩培地:0.4%の胆汁(重量/容量)を含むトリプシン性大豆ブロス(TSB)を調製するには、200 mgの胆汁酸塩を50 mLのオートクレーブTSBに再懸濁します。フィルターは0.22μmフィルターを使用して滅菌します。新鮮な培地を毎週作る
筆記：日常的に使用される胆汁酸塩は、ヒツジとウシの胆嚢から分離されたコール酸ナトリウムとデオキシコール酸ナトリウムの1:1の混合物です。前に実証したように、胆汁酸塩によるバイオフィルム形成にはグルコースの存在が必要でした。TSBは、Luria-Bertani(LB)ブロスに比べてグルコースを追加しました。したがって、赤痢菌および分析された他の腸内病原体におけるバイオフィルム形成を誘導するのに十分であった。分析する細菌によっては、異なるグルコース濃度または異なる糖要件が必要になる場合があります。
- 0.5% w/v crystal v, water: 2.5 gのcrystal violetを500 mLの蒸留水に溶解します。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。
2. バクテリアの調製
- 無菌培養チューブ内で、3 mLのTSBに1つの十分に分離されたコロニーを接種することにより、試験する細菌株の一晩培養物を増殖させます。225 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートし、一晩インキュベーションします(16〜24時間)。
手記：菌株は、2〜4週間ごとに冷凍庫のストックから再採取し、2週間以内のプレートに維持する必要があります。
3. 固相接着アッセイ
>注:このアッセイは、96ウェルプレート法を使用して付着細菌を定量します。バクテリアは平らな底板で静的に増殖します。洗浄は非付着性細菌を除去するために行われ、付着性細菌はクリスタルバイオレットで染色されます。クリスタルバイオレット染色は、ペプチドグリカンを細菌細胞壁に結合し、エタノールを用いて可溶化することができます。付着細菌の数は、クリスタルバイオレットの保持に基づいて決定されます。
- 1.5 mLチューブを2本セットします。TSBまたはTSB +胆汁酸塩(BS)でラベル付けします。
- TSBまたはTSB + BSを1mLそれぞれのチューブに加えます。
- チューブに20μLの一晩培養液(1:50希釈)を接種します。
- 無菌で透明、平底の組織培養処理済み96ウェルプレートで、130 μL/ウェルの未接種コントロール培地を3つのウェルに加えて、ブランクコントロールとして機能します。テストするメディアタイプ(TSBおよびTSB + BS)ごとに3つのコントロールウェルを設定します。
- 130 μL/ウェルの接種培養物を3つのウェルに加え、すべての実験条件がトリプリケートでプレーティングされるまで繰り返します。
- 37°Cで4〜24時間静的にインキュベートします。
- プレートリーダーを使用して、OD600を記録します。コントロールウェルを「ブランク」に設定します。コントロールメディウムが透明で、濁りの証拠がないことを確認します。濁りが検出された場合は、実験を破棄します。OD600 値は、細菌株間で成長率に大きな違いがある場合に、データの正規化に使用できます。
- プレートを静かに傾け、ウェルの下端で培地をゆっくりと吸引することにより、真空ラインを使用して培地を取り出します。プラスチック表面にある付着性細菌集団を乱すことなく、すべての培地を必ず収集してください。インキュベーション期間中に細胞外多糖類(EPS)マトリックスが産生された場合、マトリックスは白色の沈殿物として視覚化されます。EPSマトリックスを乱さないでください。
- ウェルを200 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一度優しく洗浄します。バキュームラインを使用してPBSウォッシュを取り外します。
- プレートを裏返して乾かします。乾燥させるには最低20分待ちます。
手記：バイオフィルムは染色前に完全に乾燥させる必要があるため、このステップでプロトコールを数時間または一晩中断することができます。乾燥時間が長くなっても染色手順は変わりませんが、不完全な乾燥は結果の定量化と再現性に影響を与えます。
- 各実験に150 μLの0.5%クリスタルバイオレットを加え、ウェルを制御します。
- 室温(RT)で5分間インキュベートします。
- ウェルを400μLの蒸留水で一度洗浄します。追加されたボリュームは、ウェルの側面から残留クリスタルバイオレットの汚れを取り除くのに役立ちます。バキュームラインで洗浄液を取り出します。
- ウェルを200μLの蒸留水で5回洗浄します。バキュームラインで洗浄液を取り出します.
手記：定量化には、徹底的な洗浄が重要です。ブランクウェルが蒸留水から透明になり、クリスタルバイオレットの汚れが残っていない場合は、次のステップに進みます。
- プレートを反転させて乾かし、光から保護します。上記のようにプレートが完全に乾燥していることを確認してください。
- ウェルを200μLの95%エタノールで染色します。プレートをシェーカーで30分間インキュベートします。特に高温での蒸発を避けるために、この手順を4°Cで実行します。
- プレートリーダーを使用して、光学濃度を540(OD540)で記録します。
手記：クリスタルバイオレットの最大吸光度の波長は590nm近くです。文献では、結晶紫色吸光度についてOD540〜OD595の範囲が報告されています。したがって、プレートリーダーに基づいて利用可能な波長を選択してください。