EPSマトリックス検出による胆汁酸塩誘導バイオフィルム形成の研究アッセイ

要約

出典: Nickerson, K. P., et al. 腸内病原体における胆汁酸塩誘導バイオフィルム形成:同定と定量化のための技術。 (2018年)。

このビデオは、胆汁酸塩によって誘発されるバイオフィルム形成を定量化するための蛍光ベースの方法を示しています。病原性腸内細菌の培養物に胆汁酸塩を添加すると、バイオフィルムの細胞外高分子物質(EPS)マトリックス中の多糖類に結合する蛍光レクチンを用いてバイオフィルムの作製が検出されます。

プロトコル

1. 試薬の調製

1. 胆汁酸塩(BS)培地:0.4%の胆汁(重量/容量)を含むトリプシン性大豆ブロス(TSB)を調製するには、200 mgの胆汁酸塩を50 mLのオートクレーブTSBに再懸濁します。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。新鮮なミディアムを毎週作る.
   筆記：日常的に使用される胆汁酸塩は、ヒツジとウシの胆嚢から分離されたコール酸ナトリウムとデオキシコール酸ナトリウムの1:1の混合物です。前に実証したように、胆汁酸塩によるバイオフィルム形成にはグルコースの存在が必要でした。TSBは、Luria-Bertani(LB)ブロスに比べてグルコースを追加しました。したがって、赤痢菌および分析された他の腸内病原体におけるバイオフィルム形成を誘導するのに十分であった。分析する細菌によっては、異なるグルコース濃度または異なる糖要件が必要になる場合があります。
2. 0.5% w/v crystal v, water: 2.5 gのcrystal violetを500 mLの蒸留水に溶解します。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。
3. フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に結合したコンカナバリンA(ConA):1x PBSでストックを再構成します。10 mgの濃縮ストックを400 μLの1x PBSで最終濃度25 μg/mLに希釈し、光から保護します。
4. PBS +グルコース:0.2 gのグルコースを10 mL 1x PBS(2% w / vグルコース最終)に溶解します。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。使用当日に新鮮にお作りください。
5. PBS +胆汁酸塩:40 mgを10 mL 1x PBS(0.4%w / v胆汁酸塩最終)に溶解します。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。使用当日に新鮮にお作りください。
6. PBS +グルコースと胆汁酸塩:40 mgの胆汁酸塩と0.2 gのグルコースを10 mL 1x PBS(0.4%w / v胆汁酸塩と2%w / vグルコース最終)に溶解します。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。使用当日に新鮮にお作りください。
7. LB寒天プレートを準備します。
8. ホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド固定:810 μLのホルムアルデヒド(37%ストック溶液、3%最終濃度)と125 μLのグルタルアルデヒド(25%ストック溶液、0.25%最終濃度)を1x PBS14 mLに加えます。よく混ぜ合わせ、4°Cで保存します。適切に使用するには、修正は冷たくする必要があります。
   注意：この修正は有毒であり、有害廃棄物の処理が必要です。
9. 退色防止用封入剤溶液:4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色剤を含む退色防止用封入剤溶液を使用して、免疫蛍光顕微鏡サンプルの光退色を抑制し、細菌のDNAを蛍光染色します。

2. バクテリアの調製

1. 無菌培養チューブ内で、3 mLのTSBに1つの十分に分離されたコロニーを接種することにより、試験する細菌株の一晩培養物を増殖させます。37 °Cでインキュベートし、225 rpmで振とうして一晩インキュベーションします(16 - 24 時間).
   手記：菌株は、2〜4週間ごとに冷凍庫のストックから再回収し、2週間以内のプレートに維持する必要があります。

3. EPS マトリックス検出

>注:これらの補完的なアッセイは、EPSを定量化し、可視化します。どちらの場合も、EPSはレクチンを使用して多糖類を結合することで検出されます。蛍光標識タンパク質により定量が可能です。

1. EPSの半定量的検出
   1. 1.5 mLチューブを2本セットします。TSBまたはTSB + BSのラベル。
   2. TSBまたはTSB + BSを1mLそれぞれのチューブに加えます。
   3. 20 μLの一晩培養液(1:50希釈)をチューブに接種します。
   4. 無菌の黒色平底組織培養処理済み96ウェルプレートで、130 μL/ウェルの未接種コントロール培地を3つのウェルに加え、ブランクコントロールとして使用します。試験する培地タイプごとに3つのコントロールウェルを設定します。130 μL/ウェルの接種培養物をウェルに加え、すべての実験条件がトリプリケートでプレーティングされるまで繰り返します。
   5. 37°Cで4〜24時間静的にインキュベートします。
   6. 培地をピペット(理想的にはマルチチャンネルピペット)を備えた透明な96ウェルプレートに移します。付着した集団やプラスチック表面にあるEPSを乱すことなく、すべての培地を収集するように注意してください。扠置く。
   7. 1x PBS中のホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドの200 μL/ウェルを使用して、黒板を室温で15分間固定します。
   8. 付着母集団が固定されている間に、ステップ 1.1.6 の上清画分を評価します。プレートリーダーを使用して、_OD600を記録します。コントロールウェルを「ブランク」に設定します。コントロールメディウムが透明で、濁りの証拠がないことを確認します。濁りが検出された場合は、実験を破棄します。
      1. あるいは、アッセイ全体を黒色の透明な底板で実施することもできます。このような状況では、OD₆₀₀の値を記録し、ステップ3.1.7に進む前に培養培地をその後廃棄することができる。OD₆₀₀の値は、細菌株間で成長率に大きな違いがある場合に、データを正規化するために使用できます。
   9. 修正を取り外し、有害廃棄物として廃棄します。
   10. ウェルを200 μL/ウェルの滅菌PBSで2回優しく洗浄します。プレートを静かに傾け、ウェルの下端で洗浄液をゆっくりと吸引することにより、真空ラインを使用してPBS洗浄液を取り出します。
   11. 25 μg/mL ConA-FITCを150 μL/ウェル加え、室温で15分間インキュベー
   トします。
   12. 200μLのPBSで2回やさしく洗います。
   13. 各ウェルに150 μLのPBSを加えます。488nmで蛍光を記録します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプシン大豆スープ	シグマ・アルドリッチ	22092から500G
コンカナバリン-A FITC	シグマ	C7642-10mg
グルコース	シグマ	G7021-1KG
胆汁酸塩	シグマ	B8756-100G
LB寒天	シグマ	L7533-1KG
14 mL培養チューブ、17 x 100 mm、プラスチック、滅菌済み	漁夫	14-959-11B
Vectashieldハードセット退色防止剤(DAPI付き	ベクターラボラトリーズ	H-1500
ホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	F1635-500
グルテアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	G6257
平底96ウェルプレート(透明)	TPPとは	92696
平底96ウェルプレート(黒)	グライナーバイオワン	655076
平底24ウェルプレート(透明)	TPPとは	92424
96ウェルプレートリーダー	スペクトラマックス
蛍光プレートリーダー	Biotekシナジー2
共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡	ニコンA1共焦点顕微鏡
37°C振とうインキュベーター	ニューブランズウィックサイエンティフィックエクセラE25
37°Cプレートインキュベーター	サーモラインシリーズ5000

シリーズ 培地 の ) の