1. 試薬の調製
- 胆汁酸塩培地:0.4%の胆汁(重量/容量)を含むトリプシン性大豆ブロス(TSB)を調製するには、200 mgの胆汁酸塩を50 mLのオートクレーブTSBに再懸濁します。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。新鮮なミディアムを毎週作る.
筆記：日常的に使用される胆汁酸塩は、ヒツジとウシの胆嚢から分離されたコール酸ナトリウムとデオキシコール酸ナトリウムの1:1の混合物です。前に実証したように、胆汁酸塩によるバイオフィルム形成にはグルコースの存在が必要でした。TSBは、Luria-Bertani(LB)ブロスに比べてグルコースを追加しました。したがって、赤痢菌および分析された他の腸内病原体におけるバイオフィルム形成を誘導するのに十分であった。分析する細菌によっては、異なるグルコース濃度または異なる糖要件が必要になる場合があります。
- 0.5% w/v crystal v, water: 2.5 gのcrystal violetを500 mLの蒸留水に溶解します。フィルターは0.22μmフィルターを使用して滅菌します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+グルコース:0.2 gのグルコースを10 mL 1x PBS(2% w / vグルコース最終)に溶解します。フィルターは0.22μmフィルターを使用して滅菌します。使用当日に新鮮にお作りください。
- PBS +胆汁酸塩:40 mgを10 mL 1x PBS(0.4%w / v胆汁酸塩最終)に溶解します。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。使用当日に新鮮にお作りください。
- PBS +グルコースと胆汁酸塩:40 mgの胆汁酸塩と0.2 gのグルコースを10 mL 1x PBS(0.4%w / v胆汁酸塩と2%w / vグルコース最終)に溶解します。フィルターは0.22μmフィルターを使用して滅菌します。使用当日に新鮮にお作りください。
- LB寒天プレートを準備します。
2. バクテリアの調製
- 無菌培養チューブ内で、3 mLのTSBに1つの十分に分離されたコロニーを接種することにより、試験する細菌株の一晩培養物を増殖させます。225 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートし、一晩インキュベーションします(16〜24時間)。
手記：菌株は、2〜4週間ごとに冷凍庫のストックから再ストリークし、2週間以内のプレートに維持する必要があります。
3. 分散アッセイ
>注:このアッセイでは、細菌分散によるバイオフィルムの分解が検出されます。ここでは、成熟したバイオフィルムが確立され、その後(通常は翌日)、培地がPBSまたは補充されたPBSに置き換えられます。次に、上清成分を評価して、バイオフィルムから解離した細菌の数を定量
化します。
- 1.5 mLチューブを2本セットします。TSBまたはTSB + BS(胆汁酸塩)でラベルを付けます。
- TSBまたはTSB + BSを1mLそれぞれのチューブに加えます。
- チューブに20μLの一晩培養液(1:50希釈)を接種します。
- 無菌で透明、平底の組織培養処理済み96ウェルプレートで、130 μL/ウェルの未接種コントロール培地を3つのウェルに加えて、ブランクコントロールとして機能します。テストするメディアタイプごとに 3 つのコントロールウェルを設定します。
- 130 μL/ウェルの接種培養物を3つのウェルに加え、すべての実験条件がトリプリケートでプレーティングされるまで繰り返します。
- プレートを37°Cで4〜24時間静的にインキュベー
トします。
- 続行する前に、PBS、PBS +グルコース、PBS +胆汁酸塩、およびPBS+胆汁酸塩+グルコースを37°Cに温めます。
- プレートリーダーを使用して、光学濃度OD600を記録します。コントロールウェルを「ブランク」に設定します。メディウムが透明で、濁りの証拠がないことを確認します。濁りが検出された場合は、実験を破棄します。OD600 値は、細菌株間で成長率に大きな違いがある場合に、データの正規化に使用できます。
- バキュームラインを使用して培地を取り出します。プラスチック表面にある付着性集団を乱すことなく、すべての培地を必ず収集してください。
- ウェルを200 μL/ウェルの滅菌PBSで2回優しく洗浄します。バキュームラインを使用してPBSウォッシュを取り外します。
- 洗浄液を130 μL/ウェルで、PBS、PBS +グルコース、PBS +胆汁酸塩、PBS +胆汁酸塩+グルコースの3つのウェルに入れます。これらの試薬は、37°Cに予熱する必要があります。
- プレートを37°Cで30分間インキュベートします。
- プレートを37°Cインキュベーターから慎重に取り外します。上清を新鮮で滅菌済みの96ウェルプレートに移します。
- 96ウェルプレートまたは希釈ブロックを使用して、上清の10倍(1:10)段階希釈液を滅菌PBSに調製します><。
手記：希釈シリーズは、試験する細菌株に応じて、希釈されていないものから10-6までの範囲である必要があります。パイロット実験を実施して、最適な希釈範囲を決定できます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各希釈液5 μLをLB寒天上にスポットプレートします。37°Cで一晩インキュベートします。翌日のコロニーをカウントし、回収コロニー形成単位(CFU)を決定する際に希釈係数を考慮します。1x PBS コントロール(100% に設定)に対する分散率を計算するには、各処理条件からの回収 CFU を 1x PBS コントロールサンプルからの回収 CFU で除算します><。
手記：目的の細菌株用のルーチン培地プレートも使用できます。たとえば、赤痢菌はコンゴの赤いプレートにメッキできます。適切なスポットめっき技術のために、プレートが乾いていることを確認してください。
