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1. 真菌コロニー上の細菌のIn vitroバイオフィルムの調製
- 細菌培養物を5,000 x gで3分間遠心分離し、ペレットを25 mLの滅菌0.1 Mリン酸カリウム緩衝液(25 g/L KH2PO4および2.78 g/L K2HPO4、pH 5.8)に懸濁します。このステップを1回繰り返し、同じバッファーで最終的な細菌濃度を109細胞/mLに調整します。
- 6ウェルマイクロプレートに5 mLの細菌懸濁液(またはネガティブコントロール用の滅菌0.1 Mリン酸カリウム緩衝液)を入れます。
- 菌類培養物のセロハン膜を滅菌カミソリの刃で切断し、各膜に単一の真菌コロニーを持つ正方形のセロハンを得る。鉗子を使用して菌糸を含むセロハンの正方形を固体媒体から慎重に取り除き、菌糸を含むセロハンの正方形を細菌懸濁液を含むマイクロプレートのウェルに移します。.
- 真菌のコロニーがセロハンに付着したままの状態でマイクロプレートを静かに振ってから、セロハンシートを取り外し、プレートに真菌のコロニーを残します。
- マイクロプレートを穏やかに攪拌し(~60 rpm)、研究対象の微生物に適した温度でインキュベートします。
手記：インキュベーションの時間は、バイオフィルムの確立速度と分析するステージによって異なります。P. fluorescens BBc6/L. bicolorの場合、20°Cで30分間インキュベートすると初期段階のバイオフィルムが得られ、最大16時間インキュベートすると成熟したバイオフィルムが得られます。
>2. レーザー走査型共焦点顕微鏡によるバイオフィルム形成の解析
- サンプル調製
- プランクトン性細菌および菌糸に静電的に付着した細菌を除去するには、真菌を5 mLの強塩溶液(NaCl、17 g/L)で満たされた新しい6ウェルマイクロプレートに移し、1分間静かに振とうします。
- 真菌を5 mLの滅菌0.1 Mリン酸カリウム緩衝液を含む新しい6ウェルマイクロプレートに移し、2分間静かに振とうし、真菌を新鮮なリン酸カリウム緩衝液に移します。
メス- で画像化する真菌コロニーの一部を、リン酸カリウム緩衝液に保持しながら切断し、得られた部分に真菌コロニーの約半分が含まれるようにします。
- サンプルを染色するには、適切な蛍光色素(分析の目的によって異なります)を含む滅菌水で満たされたペトリ皿に移し、暗所でインキュベートします。
- 真菌ネットワークを可視化するには、例えば、Congo Red(最終濃度0.1%、インキュベーション5分)、Alexa Fluor 633に結合したコムギ胚芽凝集体(WGA)レクチン(最終濃度10 μg/mL、インキュベーション10分)またはFUN1(最終濃度10 μM、インキュベーション10分)などを使用します。
- 非蛍光タグ付き細菌を使用する場合は、市販されている多数の細胞透過性DNA色素の中からDNA特異的な蛍光プローブで細菌細胞を対比染色します。例えば、DAPI(最終濃度0.25 μg/mL、インキュベーション10分)を使用します。
- マトリックスタンパク質を可視化するには、タンパク質染色剤を使用します。
- 染色後、サンプルを滅菌0.1 Mリン酸カリウム10 mLが入ったシャーレ蓋に移してサンプルをすすぎ、1分間静かに振とうします。
- スライドをペトリ皿の蓋に半分沈め、カットした部分をスライドの上に浮かべます。次に、スライドを緩衝液からゆっくりと取り出し、サンプルがスライドに穏やかに沈殿するのを待ちます
手記： このステップでは、バイオフィルムの乱れを避けるために、ゆっくりと進むことが非常に重要です。
- 最後に、10 μlの退色防止封入剤をサンプルに加え、ガラスカバースリップで覆います><。
手記：スライドを調製したら、バイオフィルム構造の変更を避けるために、できるだけ早く(最大30分以内に)顕微鏡分析を行う必要があります。