共焦点顕微鏡法を用いた異なる腫瘍領域における常在性T細胞遊走のリアルタイム解析

要約

出典:Peranzoni, Elisa, et al.共焦点顕微鏡を用いたヒト肺腫瘍切片の常在型CD8Tリンパ球のEx vivoイメージング。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオでは、ヒト肺腫瘍スライス内の蛍光結合抗体で標識された常在腫瘍浸潤CD8 T細胞のイメージングについて説明しています。この技術により、共焦点顕微鏡を用いたCD8 T細胞の遊走のリアルタイム解析が可能になります。

プロトコル

1. 常在CD8 T細胞と腫瘍細胞の免疫染色

1. 抗体(最終濃度10 μg/mL)と核色素(最終濃度1 μg/mL)をフェノールレッドを含まないRPMI-1640培地で希釈します
   手記：蛍光結合型抗CD8抗体(マウスIgG、クローンSK1)および抗EpCAM(上皮細胞接着分子)(マウスIgG HEA-125)抗体を使用して、CD8 Tリンパ球および腫瘍上皮細胞をそれぞれ標識します。蛍光共役型抗CD90/Thy1(マウスIgG、クローン5E10)抗体を使用して、線維芽細胞および活性化内皮細胞を標識します。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を使用して、細胞の核を損傷した原形質膜で標識し、組織の生存率を評価します。
2. インキュベーターから培養プレートを取り外し、ピペットを使用してステンレス鋼ワッシャー内の液体を吸引します。細胞培養インサートの下に置いた1.1 mL RPMI-1640培地を取り出さないでください。
3. スライスに触れず、ピペットチップを使用して、抗体を含む溶液40μLを各腫瘍スライスに加えます。
4. プレートを37°Cで15分間インキュベートし、抗体染色を行います。
5. 細い鉗子でワッシャーを取り外し、スライスを取り出し、フェノールレッドを含まないRPMI-1640メディアに10秒間浸します。スライスを細胞培養インサートに戻し、フェノールレッドフリーのRPMI-1640培地を個々のスライスに一滴加えます。プレートを37°Cに10分間維持します。イメージングに進みます。

2. ヒト肺腫瘍切片内の常在型CD8 T細胞遊走のイメージングと解析

>注:このプロトコルで使用される共焦点顕微鏡は、25倍水浸対物レンズ(25x / 0.95 N.A.)を備えた直立回転ディスクです。

1. 顕微鏡のセットアップの準備
   1. イメージングセッションを開始する数時間前に、顕微鏡のヒートチャンバーの温度を37°Cに設定します。
   2. 酸素化(5% CO₂、95% O₂)フェノールレッドフリーRPMI培地で腫瘍切片を常時灌流するシステムを設定します(図1)。蠕動ポンプを使用して灌流媒体をイメージングチャンバーに流し、溶液を老廃物収集フラスコに吸引します。
   3. 蠕動ポンプを運転して、酸素化された溶液が灌流チューブを通過するようにします。
2. 細い鉗子で、6ウェルプレートからスライスを取り出し、フェノールレッドフリーRPMI培地で満たされた35mmプラスチック皿に移します。直径19.7mmのスライスアンカーと2mm間隔のスレッドでスライスを固定します。ペトリ皿をイメージングステージに置きますtage顕微鏡の。灌流システムの入口と出口の先端を接続します。灌流システムの電源を入れ、培地の流量を0.8 mL/minに設定します。
3. 水浸対物レンズをスライスまで下げます。明るいフィールドライトでスライスの上部に焦点を合わせます。適切な蛍光灯を使用して、CD8 T細胞、腫瘍膵島(EpCAM陽性)、および間質領域(CD90陽性)を含む関心領域を選択します。切断面および組織の深部でのDAPI染色を評価することにより、スライス内の細胞の生存率を確認します.
   注:健康なスライスには、切断面から数ミクロンのところに少数のDAPI陽性細胞しか含まれていません。
4. 次のアクションでイメージングセッションを設定します。
   1. 3つの蛍光色素の蛍光シグナルの強度に応じて、露光時間を50〜800ミリ秒、レーザー強度を20〜40%に設定します。
   2. 腫瘍スライス内で画像化するzスタックの厚さを選択します。
      手記：ここでは、z次元の総深度60〜70μmにまたがる10〜12個の光学面がキャプチャされました。
   3. 最初に標識したCD8 T細胞の約10 μm下で開始位置を選択します。
   4. 各 Z スタック イメージ間の時間間隔を 10 秒から 30 秒と合計記録時間 10 分から 30 分の間に定義します。

結果

図1:灌流システムの写真。A)フェノールレッドフリーRPMI溶液は、5%_CO2、95%_O2が豊富です。B)次に、溶液を蠕動ポンプで灌流します。C)RPMI溶液は、入口から培養皿に入ります。出口では、溶液はチャンバーからポンプによって廃棄物容器に吸引されます。吸引チップは、解析の高さを決定するレベルに設定されていることに注意してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
直立共焦点顕微鏡	ライカ	スピニングディスク共焦点の使用をお勧めします
Imarisソフトウェア	ビットプレーン		このソフトウェアは、画像の視覚化とT細胞遊走の追跡に使用されます
ファイン鉗子	世界の精密機器	14142
30 mm カルチャーインサート	ミリポア	PICM0RG50
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)ミディアム、GlutaMAXサプリメント	サーモフィッシャー	61870010	完全なRPMI培地は、10%の熱不活化ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンを添加して作られ
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャー	20012019
ハンクスバランス塩溶液(HBSS)	インビトゲン	14170088
低ゲル化温度 アガロース VII-A タイプ	シグマ・アルドリッチ	A0701
無毒のブチルシアノアクリレート接着剤、Vetbond	3メートル	1469
スライスアンカー、直径19.7、2mm間隔のねじ山	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-1415
ステンレス製ワッシャー、内径5 mm	アマゾン	B004K1FDGQ
BV605標識抗CD8(クローンSK1)	BDバイオサイエンス	565289
FITC標識抗EpCAM(クローンHEA-125)	ミルテニーバイオテック	〒130-098-113
BV510標識抗CD90(クローン5E10)	バイオレジェンド	328125
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI	サーモフィッシャー	D1306

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