>注:このプロトコルは、マウスの生物学的サンプルからの播種活性を検出するためのFRETフローサイトメトリーの使用を強調しています。また、組換えフィブリルやヒトの生体サンプルにも適合します。マウスの安楽死と脳採取は、IACUCが承認した手順に従って実施しました。
1. 脳の抽出
- イソフルラン(2%)による深部麻酔に続いて、0.03%ヘパリンを含む氷冷PBSでマウスを灌流し、Gageらに記載されている詳細に従って脳を抽出します。
- 抽出した組織をクライオバイアルに入れ、液体窒素に入れて凍結します。または、ティッシュをドライアイスで凍結します。凍結したら、組織を-80°Cに移し、必要に応じて長期間保存します
手記：このプロトコルは、全脳ホモジネートまたは微小解剖された脳領域に適合します。Hagihara et al.詳細なマイクロダイセクションプロトコルのために。
2. 生物種子材料の準備
- プロテアーゼ阻害剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)フリー)を1x TBS(トリス緩衝生理食塩水、10 mLあたり1錠)に溶解して、ホモジナイズバッファーを調製します。激しく渦を巻き、氷の上に保存します。プロテアーゼ阻害剤は、バイオセンサー細胞の生存率を維持するために、EDTAフリーでなければなりません。
- 凍結した脳組織を使い捨ての計量ボートで秤量し、5mlの円錐管に移します。氷冷均質化緩衝液を添加して、最終溶液が10%の重量/体積になるようにします。氷の上に一時的に保管してください。組織質量とその後の均質化バッファー容量は、使用する脳のサイズや領域によって異なります。ここでは、体重0.2gの成体マウス半脳を2 mLに懸濁し、10% w/vol溶液にします。
- サンプルを冷蔵室に移し、プローブソニケーターを適切な設定に調整します。Omni Ruptor(ここに表示)を使用したプローブ超音波処理の場合、電力を20%に設定し、これは約75 Wに対応します。パルサーを30%に設定し、約500ミリ秒に相当します。
- プローブソニケーターの先端を水、イソプロパノール、および水で再度すすぎ、各溶液の間にプローブを拭き取ります。プローブの側面と底面の両方をラボワイプですすぎ、拭いてください。
- 一度に1つのサンプルで作業し、プローブチップを均質化バッファーに浸し、ソニケーターを始動します。上記の電力とパルサーの設定を使用して、合計 25 パルスを供給します。組織が完全に懸濁状態にあることを確認してください。このステップ中にサンプルが泡立たないように注意してください.
手記：サンプルは、a)総量が少ない場合、またはb)ホモジネートが温まると発泡しやすくなります。この特定の装置では、250μl未満の容量で超音波処理しないでください。サンプルを冷やしておくために、このステップではチューブを氷上に保管することができます。
- 残留ライセートを拭き取ってプローブを洗浄し、10パルスをきれいな水のビーカーに送達します。プローブの側面と底面を水、イソプロパノール、および水で再度すすぎ(ステップ2.4と同様)、各ステップの間に拭いて乾かします。汚染を避けるために、サンプル間でプローブを完全にすすいでください.
手記：タウ凝集体では、サンプル間の汚染を防ぐために、より厳格な洗浄方法が必要であることはわかっていません。ただし、他のアミロイドは、文献で広く説明されている追加のケアが必要な場合があります。
- ホモジネートは、すべてのサンプルが処理されるまで氷上に保存します。
- ホモジネートを21,300 x gで4°Cで15分間遠心します。
- ペレットを乱さないように注意しながら、上清をきれいなチューブに移します。ペレットを捨てます。上清を分注し、ライセートを-80°Cで保存してさらに使用します。ただし、ホモジネートの凍結/融解サイクルは、播種効率を低下させるため、避けてください。
3. バイオセンサー細胞の再プレーティング
>注:このアッセイには、HEK 293T(細胞株#1)、RD-P301S-CFP(細胞株#2)、RD-P301S-YFP(細胞株#3)、およびRD-P301S-CFP/YFP(細胞株#4)の4つの細胞株を使用してください。アッセイに対する各細胞株の寄与については、表1を参照してください。
- 無菌環境で、培地を吸引します。温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞をすすぎ、吸引します。細胞(トリプシン-EDTA(0.05%)3 ml)をトリプシン化し、温培養培地(DMEM9 ml、ウシ胎児血清(FBS)10%)、ペニシリン/ストレプトマイシン1%、グルタマックス1%)で急冷し、直ちに細胞を円錐管に移します。
- RT.Aspirate培地で1,000 x gで5分間細胞を遠心分離し、温かい培養培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して、各細胞株の細胞密度を決定します。細胞密度は、回収時のコンフルエンシーと再懸濁量によって異なります。10 cmディッシュから採取した細胞を10 mL培地で90%コンフルエントに再懸濁し、細胞密度が約100万細胞/mLになるようにします。
- 96ウェルプレートの各ウェルが130 μl培地に35,000個の細胞を含むように、細胞+培地のマスターミックスを作成します(たとえば、100ウェルのマスターミックスを作成するには、13 mL培地に350万個の細胞を再懸濁します)。セル番号を個々の実験デザインとタイムラインに合わせて変更します。プレーティング後~18時間後の細胞処理では、96ウェルプレートの各ウェルに35,000個の細胞を加えます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、130 μlのマスターミックス細胞懸濁液を平底の組織培養処理済み96ウェルプレートの各ウェルにゆっくりとピペットで移します。メッキをしながら、ピペットの先端をプレートの底に触れないようにウェルの中央に置きます.
手記：プレーティングのフォーマットは変更できますが、プレートごとに細胞株1〜3のそれぞれに対してn = 4ウェルを作成することをお勧めします。プレートの残りの部分(n = 84)は、細胞株#4(バイオセンサー細胞)用に予約されています。
- プレートを室温で10分間放置し、細胞を沈殿させます。O/Nを37°C、5%CO2、≥80%の相対湿度でインキュベートします。
4. 細胞の処理
>注:翌日、タウバイオセンサー細胞が60〜65%コンフルエントになったら、次のように種子形質導入複合体を準備します。
- 1本のチューブで、Lipofectamineなどのトランスフェクション試薬とOpti-MEMなどの低血清培地を組み合わせて、マスターミックスを作成します。ウェルごとに、1.25 μLのトランスフェクション試薬と8.75 μLの低血清培地を添加します。チューブを静かにフリックして混合し、短時間スピンダウンして、RTで5分間インキュベートします。
- 別のチューブで、シード材料(ステップ2.9のライセートのアリコート)を還元血清培地と組み合わせます.
手記：シード材料の量は、個々の実験によって異なります。種子の量を選択するときは、サンプル中の種子の量と潜在的な毒性を考慮に入れてください。粗ホモジネートは細胞に対して毒性がある可能性があります。そのため、できるだけ小さな音量を使用して、目的の効果を監視します。以前に試験したライセート/ウェルの容量は1〜5 μlで、総タンパク質は5〜20 μgに相当します。ウェル (シード + 低血清培地) あたりの総容量が 10 μl であることを確認してください。
- 4.1および4.2で説明した2つのチューブの内容物を混合し、軽くフリックして混合し、短時間スピンダウン(1,000 x g、5秒)し、室温で少なくとも20分間、最大2時間インキュベー
トします。
- 20 μlの形質導入複合体を個々のバイオセンサーウェルの側面に静かにピペットで移します。可能であれば、テクニカルレプリケートを 3 回使用します。処理した細胞をインキュベーターに24〜48時間戻します。ステップ3.6.
で説明したのと同じ条件下でインキュベートします。
手記：この設定の適切なネガティブコントロール条件は、空のリポソームで処理されたバイオセンサー細胞(すなわち、リポソーム試薬+還元血清培地)です。なぜなら、リン脂質の適用により、リポソーム試薬に曝露されていないバイオセンサー細胞と比較して蛍光プロファイルがわずかに変化するためです。
5. FRETフローサイトメトリーのための細胞の採取
>注:細胞を回収する前(通常は処理後24〜48時間)に、標準的な倒立蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルターを使用して播種活性の予備的な読み出しを得ることができます。シード材料なしで処理された細胞(すなわち、空のリポソーム)は拡散蛍光を示しますが、シード材料で処理された細胞は強い点状および網状の細胞内封入体を示します(図1A-B)。
- マルチチャンネルピペットを使用して、全細胞培地(150 μl)を吸引します。細胞をトリプシン(50 μl)で5分間静置し、150 μlの冷やした培地で急冷します。このステップでトリプシン化の前にPBSリンスを含めないでください、それは細胞の浮き上がりとその後の細胞の損失を引き起こす可能性があるためです。フローサイトメトリー中に汚染された死細胞や破片をゲーティング戦略により排除します。
- 急冷後すぐに、細胞を96ウェル丸底プレートに移し、1,000 x gでRTで5分間遠心分離します。
- 細胞ペレットを乱さないように注意しながら、培地を吸引して廃棄します。
- 穏やかに、しかし徹底的に、細胞ペレットを50 μl 2%パラホルムアルデヒドに再懸濁し、10分間インキュベートします。あるいは、細胞をライブで泳動しますが、固定するとよりクリーンで一貫性のある結果が得られます。
- 細胞を1,000 x gでRTで5分間遠心分離し、パラホルムアルデヒドを吸引して廃棄し、細胞ペレットを乱さないように注意します。
- 細胞ペレットを200 μLのチルドフローサイトメトリーバッファー(Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)、1% FBS、1 mM EDTA)に再懸濁し、細胞凝集を避けるためにできるだけ早くプレートを泳動してください。
6. FRETフローサイトメトリー
>注:FRET対応のレーザーラインとフィルターセットを備えたMACSQuant VYBなどのフローサイトメーターを使用してください(表2)。このセクションの各ステップで、ソフトウェアの96ウェルテンプレートを使用して目的のウェルをクリックし、「再生」をクリックしてサンプルの取り込みとフローを開始します。プロットまたは統計表を作成するには、「新しい分析ウィンドウ」アイコンをクリックします。個々の 2 変量プロットの軸パラメーターを変更するには、X 軸または Y 軸のタイトルをクリックし、適切なフィルターを選択します。細胞集団または蛍光シグナルをシフトするには、適切なフィルターに関連する電圧を増減します。この装置では、<1,000イベント/秒を実行し、正確なシングルセルモニタリングを保証します。
- Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) の二変量プロットを作成し、細胞株 #1 を実行した状態で、細胞集団が左下の象限に入るまで SSC と FSC の電圧を調整します。ポリゴン ツールをクリックし、セル母集団 (ゲート P1) を定義します。すべてのゲート パラメーターについては、図 2 を参照してください。
- FSC-H (高さ) と FSC-A の 2 変量プロットを作成し、プロットの上にある [live] をクリックして P1 を選択し、このプロットにゲート P1 を適用します。セル ライン #1 が実行中の状態で、ポリゴン ツールをクリックし、1 つのセル (ゲート P2) を定義します。
- 対象のフィルター (CFP、YFP、FRET) ごとに 1 つずつ、合計 3 つのヒストグラム プロットを作成します。これらすべてのプロットにゲートP2を適用するには、プロットの上にある[live]をクリックし、[P2]を選択します。細胞株#1を実行している状態で、CFP、YFP、およびFRETヒストグラムの細胞集団の中央値がすべて0から1の間になるように電圧を調整します。CFPとFRETを測定するには、405 nmレーザーで細胞を励起し、それぞれ450/50 nmと525/50 nmのフィルターで蛍光を捕捉します。YFPを測定するには、488 nmレーザーで細胞を励起し、525/50 nmフィルターで蛍光を捕捉します。レーザーとフィルターの設定については、表2で詳しく説明します。
- FRETチャネルとYFPチャネルへのCFPスピルオーバーの補償を実行します。
手記：コンペンセーションは、蛍光スピルオーバー補正のプロセスです。蛍光スピルオーバーは、1つの蛍光色素の蛍光発光が別の蛍光色素からの信号を測定するように設計されたフィルター内で検出されるたびに発生します。適切な補正により、CFPのスピルオーバー蛍光をFRETおよびYFPチャネルから除去できます><。
手記：コンペンセーションには、蛍光陽性細胞と蛍光陰性細胞の両方の存在が必要です。したがって、CFP陽性細胞(細胞株#2)を補償するには、実行前に陰性細胞(細胞株#1)をサンプルに添加する必要があります。
- 1つのウェルから30 μlの細胞株#1懸濁液を、代償する直前に200 μlの細胞株#2懸濁液にスパイクします。
- 「Instrument Settings」アイコンをクリックし、「compensation」タブをクリックし、「matrix」にチェックを入れて補正テーブルを開きます。
- FRET-A と CFP-A の 2 変量プロットを作成し、ステップ 6.3 の説明に従ってゲート P2 を適用します。細胞株1+2を稼働させた状態で、「象限」アイコンをクリックし、蛍光陰性集団と陽性集団が下の2つの象限(それぞれゲートLL3とLR3)で区切られるように象限を描きます。
- LL3 ゲートと LR3 ゲートの FLET の蛍光強度 (MFI) の中央値を表示する統計テーブルを作成します。補正行列の FRET パラメーターを調整して、FRET 信号の MFI が LL3 と LR3 の間で等価になるまで調整します。このステップの後、FRETシグナルのMFIは未染色細胞とCFP陽性細胞の間で等しくなり、FRETチャネルへのCFPスピルオーバーがないことが示唆されます。
- YFP-A と CFP-A の 2 変量プロットを作成し、ステップ 6.3 の説明に従ってゲート P2 を適用します。手順 6.4.3 で行ったのと同様の象限 (LL4 と LR4) を描画します。
- LL4 と LR4 の YFP の MFI を表示する統計テーブルを作成します。YFP 信号の MFI が LL4 と LR4 の間で等価になるまで、補償行列の YFP パラメーターを調整します。このステップの後、YFPシグナルのMFIは未染色細胞とCFP陽性細胞の間で等しくなり、YFPチャネルへのCFPスピルオーバーがないことが示唆されます。
- ゲートのセットアップと補正に続いて、関心のあるウェルを強調表示し、プレートの残りの部分を実行します。
- すべてのサンプルを実行したら、「ファイル」をクリックしてから「コピー」をクリックしてデータファイルをエクスポートします。「データファイル」タブを選択し、実験フォルダを強調表示して、「コピー」をクリックします。
