超小型興奮性シナプス後電流(mEPSC)に対する毒素曝露の抑制効果を評価する手法

要約

出典:Hubbard, K. et al., Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem-Cell-derived Central Nervous System Neurons.J. Vis. Exp. (2015年度)

このビデオは、神経毒にさらされた後の胚性幹細胞由来ニューロンの電気生理学的分析を示しています。これらのニューロンをボツリヌス神経毒で治療すると、自発的な小さな興奮性シナプス後電流の頻度が減少し、シナプス伝達の阻害が確認されます。

プロトコル

>1. フィーダー無細胞懸濁培養への胚性幹細胞(ESC)の適応

1. ESCを37°Cで氷のスライバーが残るまで解凍します。
2. P1000ピペットを使用して、1 - 2.5 x 10⁶ 解離したESCを、10 mLの予熱済みESC培地を含む非組織培養処理皿に静かに移します。加湿組織培養インキュベーターで、37°Cおよび5%二酸化炭素(CO₂)で20時間インキュベー
トします。
3. 20時間後、10 mLの血清ピペットを使用して懸濁液培養物を15 mLのコニカルチューブに穏やかに移し、細胞を洗浄します。200 x gで3分間ペレットESC。スピン中に、新鮮なESCミディアムから低接着の皿10mlを追加します。
4. 細胞ペレットが外れないように注意しながら上清を吸引し、細胞ペレットに1 mLの新鮮なESC培地を加えます。P1000ピペットを使用して細胞を細菌皿に移し、インキュベーターに戻します。
5. 凝集体が肉眼で見えるようになるまで、細胞を毎日観察します(通常は4〜8日(d)、凝集体は0.2〜0.5mmになります)。4 日後にアグリゲートが明らかにならない場合は、手順 1.3 を繰り返します。アグリゲートが表示されたら、セクション 2 で説明されているように ESC を分離して維持します。

2. ESCの通過とメンテナンス

1. 滅菌済みの10 mLピペットを使用してESC凝集体を15 mLのコニカルチューブに移し、凝集体をコンパクトなペレットに沈殿させます(通常は3〜5分)。細胞ペレットを乱さないように注意しながら上清を吸引し、凝集体を5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。重力セトリングが推奨されますが、代わりに、時間を節約するために、100 x gで2.5分間ペレットセルをセッティングします。
2. PBSを吸引し、500 μlのトリプシンを加えます。凝集体をトリプシン中で3分間インキュベートし、37°Cの水浴で500μlのESC培地を加えてトリプシンを希釈し、P1000ピペットで10回穏やかに粉砕して凝集体を砕きます。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
3. 解離した細胞を200 x gで3分間ペレット化し、ESC培地で細胞を最終濃度1.0 x 10⁷細胞/mlに再懸濁します。150 μl (1.5 x 10⁶細胞) を10 cmの細菌皿に入れた新鮮なESC培地10 mLに移し、組織培養インキュベーターに48時間戻します。過剰なESCは、分化させるか、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加した90%ESC培地で1〜5 x 10⁶細胞/mLで凍結保存するか、廃棄することができます。
4. 通路は48時間ごとに骨材を積み、通路の準備ができている骨材は、直径が0.5mmを超えるとはっきりと見えます
   手記：凍結保存された懸濁適応細胞の解凍と培養は、ステップ1.2〜1.4に従って行われます。骨材は48〜72時間以内に継代する準備が整います。

3. ニューロンの分化

>注:手順3.1〜3.5は正午までに、手順3.7は正午以降に実施してください。鑑別手順の概要を図 1A に示します。

1. ステップ 2.1 から 2.5 のように ESC の関連付けを解除します。解離したESC350 μl (3.5 x 10⁶) を、25 mLの分化培地が入った10 cmの低アタッチメントディッシュに移します。組織培養インキュベーター内で30〜45rpmに設定されたオービタルシェーカーに、37°Cで5%_CO2を入れます。これは分化の最初の日であり、in vitro (DIV) -8.
   と呼ばれます 手記：超低アタッチメントディッシュを使用すると、メソッドのコストが増加しますが、凝集体がペトリ皿に付着することがあるため、細菌のペトリ皿よりもわずかに大きな収量が得られます。中容量と細胞数は、異なるディッシュサイズが好まれる場合は、それに応じてスケーリングできます。
2. 48時間後(DIV -6)、25 mLのピペットを使用して、分化した細胞凝集体を50 mLのコニカルチューブに移します。すぐに新鮮な25mlの分化培地をペトリ皿に加えます。
3. 骨材が2〜5分かけて沈降するのを待ち、深さ1〜2mmの目に見えるペレットを生成します。懸濁液に残っている単一細胞または小さな凝集体は無視してください。培地を慎重に吸引し、P1000を使用して細胞ペレットをペトリ皿に戻します。組織培養インキュベーターのロータリーシェーカーに置きます。
4. DIV -4 で、手順 3.2 を繰り返します。ペレットの深さは2〜4mmです。6 μM オールトランスレチノイン酸(RA)を添加した 30 mL の分化培地をペトリ皿に交換します。組織培養インキュベーターのロータリーシェーカーにさらに48時間戻ります。
5. DIV -2 で、手順 3.3 を繰り返します。この時点で、ペレットの深さは4〜8mmになります。
6. DIV-1では、セクション4と同様にめっき面を準備します。
7. DIV 0で、5 mLの事前分注および凍結神経前駆細胞(NPC)トリプシン化培地を37°Cで5〜10分間解凍し、組織培養フードに入れます。25 mLのピペットを使用して、分化凝集体を50 mLのコニカルチューブに移します。骨材が沈殿するのを待ち、培地を慎重に吸引します。ペレットを10 mlのPBSで2回洗浄し、洗浄の合間に凝集体が沈殿するようにします。
8. 2回目のPBS洗浄後、5 mLのNPCトリプシン化培地をペレットに加え、37°Cで5分間インキュベートします。
9. 0.1%大豆トリプシン阻害剤(STI)を5ml加えてトリプシンを不活性化し、反転させて混合します。10 mLの血清学的ピペットで10〜15回、比較的均質な細胞懸濁液が生成されるまで、穏やかに粉砕します。
10. 細胞懸濁液を、50 mLの円錐形チューブの上に置いた40 μmまたは70 μmの細胞ストレーナーにゆっくりと移します。すべての懸濁液をろ過したら、1 mLのN2培地を加えて残りの細胞をフィルターで洗浄し、解離した細胞懸濁液を200 x gで6分間ペレット
化します。
11. ペレットを乱さずに培地を吸引します。細胞を10 mLのN2培地で2回洗浄し、細胞を200 x gで5分間ペレット化し、P1000で洗浄の合間に回転させます。2回目の洗浄の前に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
12. N2培地に細胞を1 x 10⁷ cells/mlで再懸濁し、細胞密度150,000 - 200,000 cells/cm²で胚性幹細胞由来ニューロン(ESN)をプレート
化します。
13. 新たに播種したESNを加湿組織培養インキュベーターに37°C、5%_CO2で移し、セクション5と同様に維持します。

4. DIV 0 で神経前駆体をプレーティングするための培養表面の準備

1. 組織培養処理した皿は、めっきの少なくとも1日前に調製してください。十分なポリエチレンイミン(PEI;滅菌H₂Oで25 μg/ml)またはポリ-D-リジン(PDL;滅菌H₂Oで100 μg/ml)を添加して、組織培養処理プラスチック皿を覆い、O/Nを37°Cでインキュベートします。
2. メッキの朝、二重蒸留_H2Oで2回、PBSで1回皿を洗います。最終洗浄後、ディッシュを覆うのに十分なN2培地を追加します(例:12ウェルディッシュのウェルあたり1 ml、または6 cmディッシュあたり4 ml)。
3. ニューロンめっきの少なくとも1日前に18mmのガラスカバースリップを準備します。プラズマ洗浄により、カバースリップを4分間清掃します。
4. 洗浄したカバースリップを、大きな滅菌皿の底にあるエタノール洗浄パラフィルムに直ちに移し、ステップ4.1で調製したPEIまたはPDL溶液400μlを加えます。組織培養インキュベーターで37°Cで一晩(O/N)インキュベートします。
5. 午前中に、カバースリップを水で3回洗い、PBSに5μg/mlのラミニンを37°Cで1〜3時間加えます。ニューロンを解離する前に、ラミニンを吸引し、すぐにカバーガラスを1mlのNPC培地を含む12ウェル皿のウェルに移し、処理された側を上に向けておくようにします。
6. NPCが皿に盛り付ける準備ができるまで、皿とカバースリップを37°Cで保管します。

5. ニューロンの維持

1. DIV 1では、培地を吸引し、N2培地と交換します。
2. DIV 2および4では、培地を吸引し、B27培地と交換します。
3. DIV 8では、培地を吸引し、有糸分裂阻害剤を含むB27培地と交換して、汚染された非神経細胞を排除します。
4. DIV 12で、B27培地と交換します。
5. 準備ができるまで、5% CO₂ から DIV 12⁺ ESN を取り外さないでください。

6. 超小型興奮性シナプス後電流を定量化するためのシナプス伝達抑制測定(MIST)アッセイ

>注意:クロストリジウム神経毒は既知の最も有毒な物質であり、推定ヒトLD50値は0.1〜1 ng / kgと低くなっています。これらの毒素を使用する前に必要な承認を取得し、適切な予防措置を講じてください。

1. BoNT/AをESN培地中の所望の最終濃度である100倍に慎重に希釈し、37°Cまで温めます。DIV 21+ ESN培養物に適切な量の毒素を加え、培養皿を旋回させてインキュベーターに戻します。
2. 中毒後4時間以上で細胞を分析する場合は、毒素を皿に加え、インキュベーター内または一定のCO₂チャンバー内で直接など、5%CO₂から除去せずに渦巻く。
3. 適切な時点で、ESN培地を吸引し、細胞外記録バッファー(ERB)で2回洗浄します。5.0 μM テトロドトキシンと 10 μM ビキュクリンを添加した 4 mL の ERB を添加し、それぞれ活動電位を遮断し、GABA_A 受容体活性に拮抗します。
4. ディッシュを電気生理学リグに移します。MISTアッセイには灌流も温度制御も必要ありません。
5. マイクロピペットプーラーを使用してホウケイ酸ガラスを引っ張り、5〜10mΩの抵抗を持つ記録ピペットを作成し、細胞内記録バッファーを充填します。記録する前に、充填された記録ピペットをシリコン化試薬に静かに浸します。
6. 空気で満たされたシリンジを使用して、記録ピペットをERBに下げるときに陽圧を提供します。記録するニューロンの体細胞に記録ピペットを静かに着水させた後、陽圧を取り除き、ギガシールを形成します。保持電圧を-70mVに下げます。慎重に負圧を加えて、細胞全体の構成に侵入します。
7. 電流クランプに切り替えて、静止膜電位を監視および記録します。液体の接合電位を調整しない場合、静止膜電位は-67〜-82mVになります。
8. -70 mVの電圧クランプ記録を4〜5分間連続して実行し、小型の興奮性シナプス後電流(mEPSC)を検出します。
9. スパイク検出ソフトウェアを使用して、次の設定でmEPSC検出のために記録されたデータの4分間を分析します:しきい値、5;ローカル最大値を検索する期間、10,000 μsec。ベースラインのピークまでの時間、5,000 μsec。減衰時間を探索する周期、20,000μsec。減衰時間を求めるピークの割合、0.37。ベースラインを平均化する期間、1,000 μsec。エリアのしきい値、20;平均ピークに達するポイントの数、1;ピークの方向、負。
10. 検出されたイベントに関する情報を収集して保存します。4分間に検出されたイベントの数を240で割って、mEPSC周波数(Hz)を求めます。
11. 各ばく露条件について、8 - 12 コントロールと 8 - 12 BoNT 処理サンプルの mEPSC 周波数を収集します。年齢およびロットが一致したコントロールに対して頻度を分析します。シナプス活性の阻害率の統計的有意性を、一元配置ANOVAとDunnetttの事後検定を使用して決定します。

結果

図 1.懸濁適応ESNは有糸分裂的に安定なままであり、多能性のマーカーを発現します。(A)ESCのメンテナンスと差別化の概略図。レチノイン酸(RA)または白血病抑制因子(LIF)の有無は、+または-で示されます。初代ニューロン培養のin vitro(DIV)と古典的発生段階(DS)の比較を提供します。(B)R1、D3、C57BL/6J ES細胞株の増殖速度は、浮遊培養に移行後、5継代で安定します。(C)フローサイトメトリーのデータは、懸濁培養で25継代にわたって測定したR1、D3、およびC57BL/6J ES細胞株におけるOct3/4発現に実質的な変化を示していません(それぞれn = 6)。(D)懸濁液に適合したR1 ESCラインのルーチン継代...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
テーブル 1.ESCおよびESN
ノックアウトDMEM	ライフテクノロジー	〒10829-018	メディア:ESC培地
			処方とノート:500 mL
100x MEM NEAA	ライフテクノロジー	11140-050	メディア:4°Cで最大1か月間保存
			処方とノート:6 mL
200 mM L-アラニル-L-グルタミン	ATCCの	〒30-2115	6ミリリットル
ES認定FBS	応用幹細胞	ASM-5007	90ミリリットル
100x抗生物質	シグマ・アルドリッチ	A5955	3ミリリットル
55 mM 2-メルカプトエタノール	ライフテクノロジー	21985年023月	1.1ミリリットル
107 ユニット/mL LIF	ミリポア	ESG1107	60μL
ノックアウトDMEM	ライフテクノロジー	〒10829-018	メディア:ESC差別化媒体
			処方と注意事項:436.6 mL
100x MEM NEAA	ライフテクノロジー	11140-050	メディア:4°Cで最大1か月間保存
			処方とノート:5 mL
200 mM L-アラニル-L-グルタミン	ATCCの	〒30-2115	5ミリリットル
ESC認定美容液	応用幹細胞	ASM-5007	50ミリリットル
100x抗生物質	シグマ・アルドリッチ	A5955	2.5ミリリットル
55 mM 2-メルカプトエタノール	ライフテクノロジー	21985年023月	0.9ミリリットル
ダルベッコのPBS	シグマ・アルドリッチ	D8537	メディア: NPCトリプシン化媒体
			処方と注意事項:100 mL
0.5 M EDTA(18.3%)	シグマ・アルドリッチ	3690	メディア:5 mL分注で凍結
			処方とノート:0.266 mL
トリプシン	シグマ・アルドリッチ	T8802	50ミリグラム
ポリエチレンイミン(PEI)	シグマ・アルドリッチ	P3143	メディア:表面コーティングソリューション
			製剤および注意事項:2.5 μg/mL in H20
ポリ-D-リジン(PDL)	シグマ・アルドリッチ	P7280	メディア:1週間以内に使用
			製剤および注意事項:100 μg/mL in H20
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020	H20 で 5 μg/mL
DMEM/F12 + グルタMAX	ライフテクノロジー	〒10565-018	メディア: NPC culture medium
			処方と注意事項:492.5 mL
100x N2ビタミン	ライフテクノロジー	17502-048	メディア:4°Cで最大1か月間保存
			処方とノート:5 mL
100x抗生物質	シグマ・アルドリッチ	A5955	2.5ミリリットル
神経基礎A	ライフテクノロジー	〒10888-022	メディア:ESN培地
			処方とノート:482.5 mL
50x B27ビタミン	ライフテクノロジー	17504-044	メディア:4°Cで最大1か月間保存
			処方とノート:10 mL
200 mM L-アラニル-L-グルタミン	ATCCの	〒30-2115	5ミリリットル
100x抗生物質	シグマ・アルドリッチ	A5955	2.5ミリリットル
5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FDU)	シグマ・アルドリッチ	F0503	メディア:2000x Mytotic inhibitors aliquot and save at -20 °C
			製剤と注:dd 150 mg 5FDUおよび350 mgウリジンを10 mL神経基礎A.滅菌フィルター、分注および凍結。ESN培地に2000xを使用してください。
ウリジン	シグマ・アルドリッチ	U3003
TrypLE Expressトリプシン	ライフテクノロジー	〒12605-010	メディア: その他
			処方と注意事項:RTで保存
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D8418	RTでストア
大豆トリプシン阻害剤(STI)	シグマ・アルドリッチ	T6414	-20°Cで保存
エタノール	シグマ・アルドリッチ	E7023	RTでストア
アスコルビン酸	シグマ・アルドリッチ	A4403の	100 mgのアスコルビン酸を5.7 mLの50:50 DMSO/エタノール混合物に溶解して、100 mMストックを調製します。
レチノイン酸(RA)	シグマ・アルドリッチ	R2625	15 mg RAを9 mL 50:50 DMSO/エタノールに再懸濁します。100 mMアスコルビン酸ストック1 mLを補給します。分注し、-80°Cで保存し、6ヶ月間安定です。
テーブル2.霧
NaCl	シグマ・アルドリッチ	71386	メディア:細胞外記録バッファ
			最終濃度(mM):58.44
			MW:140
KClの	シグマ・アルドリッチ	60135	メディア:(ERB; pH = 7.3、315 mO)
			最終濃度(mM):74.56
			MW:3.5
NaH2PO4	シグマ・アルドリッチ	S3139	メディア:4°Cで少なくとも6ヶ月間安定しています。
			最終濃度(mM):119.98
			メガワット:1.25
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	21115	最終濃度(mM):110.98
			MW:2
MgCl2	シグマ・アルドリッチ	63069	最終濃度(mM):95.21
			MW:1
D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8644	最終濃度(mM):180.16
			メガワット:10
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H0887-J	最終濃度(mM):238.3
			メガワット:10
K-グルコン酸	シグマ・アルドリッチ	P1847	メディア:細胞内記録バッファー
			最終濃度(mM):234.5
			MW:140
NaCl	シグマ・アルドリッチ	71386	メディア:(IRB; pH = 7.3, 320 mO)
			最終濃度(mM):58.44
			MW:5
Mg-ATPの	シグマ・アルドリッチ	A9187の	メディア:4°Cで少なくとも6ヶ月間安定しています。
			最終濃度(mM):507.18
			MW:2
Li-GTPの	シグマ・アルドリッチ	G5884	最終濃度(mM):523.18
			メガワット:0.5
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	21115	メディア:4°Cで少なくとも6ヶ月間安定しています。
			最終濃度(mM):110.98
			MW:0.1
MgCl2	シグマ・アルドリッチ	63069	メディア:4°Cで少なくとも6ヶ月間安定しています。
			最終濃度(mM):95.21
			MW:1
エグタ	シグマ・アルドリッチ	E3889	380.35 培地:4°Cで6 mo. 以上安定 最終濃度(mM):380.35 MW:1
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H0887-J	メディア:4°Cで少なくとも6ヶ月間安定しています。
			最終濃度(mM):238.3
			メガワット:10
バイキュクリン	トクリス	131	メディア: その他
			最終濃度(mM):0.01
			総出力:417.85
CNQXの	シグマ・アルドリッチ	C239	最終濃度(mM):0.01
			メガワット:276.12
テトロドトキシン	シグマ・アルドリッチ	A8001	最終濃度(mM):0.005
			メガワット:645.74
BoNT/A-/G	メタバイオロジクス	該当なし	メディア：
			最終濃度(mM):未定
			総出力:150,000
破傷風毒素	シグマ・アルドリッチ	T3194	最終濃度(mM):未定
			総出力:150,000
シグマコート	シグマ・アルドリッチ	SL-2	最終濃度(mM):N / A
			MW:なし / A
テーブル3。機器とソフトウェア
MiniAnalysis (バージョン 6.0.7)	Synaptosoft株式会社	該当なし	イベント検出ソフトウェア
Igor Pro(バージョン6.22A)	ウェーブメトリクス	該当なし	録音を視覚化するためのソフトウェア
パッチマスター	ヘカ	該当なし	データ収集ソフトウェア
オリンパス IX51 倒立顕微鏡	オリンポス	該当なし
マイクロマニピュレーター	サッターインストゥルメント	MPC-365
パッチクランプアンプ	ヘカ	ECB10USB
マイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-1000
ホウケイ酸キャピラリーチューブ	サッターインストゥルメント	B150-86-10	コーニング7740
18 mmガラスカバースリップ	漁夫	12-545-84
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	PDC-32Gの
セルストレーナー(40μm)	漁夫	08-771-1
ストーバルベリーダンサーシェーカー	漁夫	15-453-211
低密着皿	漁夫	05-539-101	コーニング3262
バクテリア皿	VWRの	25384-302	100 x 15ミリメートル

の の 名 します。 の 型 の の の の してください の の の の 名 の の (代表)