プリマキンと光線力学療法によるマクロファージ食作用効率の測定

要約

このビデオは、プリマキンによるマウスマクロファージの食作用効率に対する光線力学治療の影響の評価を示しています。治療を受け、感染したマクロファージは活性酸素種を生成し、プレート上のコロニーの減少によって明らかな選択的な真菌死を引き起こします。

プロトコル

1. クリプトコッカス細胞の調製

1. 滅菌酵母-麦芽抽出物(YM)寒天プレートに接種ループで試験生物をストリークアウトします。
2. 寒天プレートを30°Cで48時間インキュベートします。
3. 接種ループを使用して5つの単一コロニーをすくい取り、5 mLの滅菌蒸留水に懸濁します。
4. McFarland標準試料を使用して細胞を標準化し、RPMI-1640培地1mLあたり0.5〜10×⁵〜2.5〜10×⁵コロニー形成単位(CFU)の細胞濃度を得ます。
5. 100 μLの細胞懸濁液を、播種されたマクロファージを含むマイクロタイタープレートのウェルに分注します(以下のセクションを参照)。

2. マクロファージの調製

1. 10 mLのRPMI-1640培地を含む組織フラスコで、マウスマクロファージ細胞株RAW 264.7を培養し、20 mg/mLのストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、20 U/mLのペニシリン、および10%のウシ胎児血清を補充します。
2. フラスコを37°Cに設定した5%_CO2インキュベーターに80%のコンフルエントに達するまで置きます。
3. セルスクレーパーを使用して細胞をそっとこすり落とします。
4. 懸濁した細胞を15 mLの遠心チューブに移します。
5. トリパンブルー染色を使用して細胞生存率を決定します.
   手記： 85% を超える生存率スコアが推奨されます。
6. 血球計算盤を使用して、新鮮な無菌RPMI-1640培地の10 mL溶液を使用して、マクロファージの細胞濃度を1 × 10⁶細胞/mLに調整します。
7. 100 μLの細胞懸濁液を滅菌済みの96ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルに分注します。
8. プレートを5%_CO2インキュベーターで37°C.
   で一晩インキュベートします。 手記： 使用前に、一晩使用した培地を吸引し、100 μLの新鮮で滅菌済みのRoswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培地と交換する必要があります。

3. 化合物の調製

1. 試験用光増感剤とプリマキン(PQ)を蒸留水に溶解し、ストック溶液を調製します。
2. 化合物をRPMI-1640培地でさらに希釈します.
   手記： RPMI-1640メディア中の蒸留水の最終量は、1%を超えてはなりません。
3. 調製した光増感剤の100 μL溶液を分注して、所望の濃度を4倍に、すでに播種したマクロファージおよびクリプトコッカス細胞を含む適切なウェルに分注します。

4. 光線力学処理(PDT)の実施

1. 次の実験条件を設定します。
   1. 0 μM の PQ で細胞を共培養し、暗光 (DL) に 2 分間曝露した細胞 (すなわち、未処理 (非 Rx) 細胞)
   2. 細胞を6 μMで共培養し、DLに2分間曝露(すなわち、薬物効果)
   3. 15 μMのPQ細胞を共培養し、DLに2分間曝露(すなわち、薬物効果)
   4. 細胞を30 μMのPQで共培養し、DLに2分間曝露した(すなわち、薬物効果)
   5. 0 μM の PQ で細胞を共培養し、紫外線 (UV) に 2 分間さらした (UV 効果)
   6. 6 μM の PQ で細胞を共培養し、紫外線 (UVL) に 2 分間曝露 (PDT 効果)
   7. 細胞を15 μMのPQで共培養し、UVLに2分間曝露(PDT効果)
   8. 細胞を30 μMのPQで共培養し、UVLに2分間曝露(すなわち、PDT効果)
      手記：共培養細胞は、UVL(該当する場合)に曝露する前に、暗闇(該当する場合)で30分間PQと反応させる必要があります(該当する場合)
      手記：現在の研究では、PQのUV/Vis吸収が260nmであり、これは殺菌ランプのUV範囲にあることを決定しました。後者のため、PDTを実装するための光源として、クラスII生物学的安全キャビネットに取り付けられた殺菌紫外線C(UVC)ランプを使用しました。ランプの公称電力は30ワットと報告されています。細胞は、現在の研究ではランプから約20cmに保たれました。この距離では、ランプの放射出力は625μW / cm²と推定されます。

5. クリプトコッカス細胞の生存を決定するためのコロニーのカウント

1. 上記のように共培養細胞の光線力学処理を開始した後、プレートを5%_CO2中で37°Cで18時間インキュベートします。
2. 18時間後、上清を吸引します。
3. ウェルを200 μLのリン酸緩衝液(PBS)で洗浄し、非内在化細胞を洗い流します。この手順を 3 回繰り返します。
4. 0.1% Triton X-100 300 μL をウェルに加え、室温で 10 分間インキュベー
トします。
5. ウェルの内容物を吸引し、滅菌済みの1.5mLプラスチックチューブに分注します。
6. 蒸留水で細胞を10分の1に希釈します.
   手記：寒天プレート上で30〜300コロニーを回収できるように希釈を調整します。
7. 希釈液50μLを酵母モルト(YM)寒天プレートにピペットで移します。
8. スプレッドプレート法を使用して、寒天プレートの表面に細胞の合流式芝生を作成します。
9. プレートを30°Cで48時間インキュベートします。
10. 寒天プレート上に開発されたコロニー形成ユニット(CFU)を数えます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	メルク		YMプレートの準備に使用
酵母エキス	メルク		YMプレートの準備に使用
麦芽エキス	メルク		YMプレートの準備に使用
ペプトン	メルク		YMプレートの準備に使用
グルコース	メルク		YMプレートの準備に使用
トリパンブルーステイン	シグマ・アルドリッチ		生細胞と死細胞を列挙するには
マクファーランド規格	フィッシャーサイエンティフィック		セルを標準化するには
プリマキン	メルク		感光剤として使用
リン酸緩衝液(PBS)	シグマ・アルドリッチ		細胞の洗浄と希釈
RPMI-1640ミディアム	バイオクロム		マクロファージの培養培地
ウシ胎児血清(FBS)	バイオクロム		RPMI-1640培地を補完するために使用
ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ		RPMI-1640 ミディアムに追加
0.1% トリトン X-100	シグマ・アルドリッチ		マクロファージの溶解に使用
96ウェル平底マイクロタイタープレート	グライナーバイオワン		反応を運び出す容器として使用される
ティッシュフラスコ	ラセック		マクロファージの培養に使用
50 mL遠心チューブ	ラセック		マクロファージの封じ込めに使用
セルクラッパー	ラセック		組織フラスコからマクロファージを分離するために使用
接種ループ	ラセック		寒天プレートに培養物をストリークするために使用されます
血球計算盤	マリエンフィールド		マクロファージの細胞濃度を決定するため
1.5 mLプラスチックチューブ	メルク		反応を運び出す容器として使用される
UVLの	ESCOの		感光剤の活性化に使用されます
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー		マクロファージのインキュベーションに使用
クラス II安全キャビネット	ESCOの		ユーザーに害を及ぼすことなく、病原体を安全に取り扱うこと。